Uso di pinzette ottiche doppie e microfluidica per studi a singola molecola

Riepilogo

La biochimica visiva a singola molecola studiata attraverso camere microfluidiche è notevolmente facilitata utilizzando barili di vetro, siringhe a tenuta di gas, connessioni stabili di tubi alle celle di flusso ed eliminazione delle bolle posizionando valvole di commutazione tra le siringhe e i tubi. Il protocollo descrive due trappole ottiche che consentono la visualizzazione delle transazioni del DNA e delle interazioni intermolecolari.

Abstract

La biochimica visiva è una potente tecnica per osservare le proprietà stocastiche di singoli enzimi o complessi enzimatici che sono oscurati nella media che avviene negli studi in fase di massa. Per ottenere la visualizzazione, le pinzette ottiche doppie, in cui una trappola è fissa e l'altra è mobile, sono focalizzate in un canale di una camera microfluidica multi-flusso posizionata sul palco di un microscopio a fluorescenza invertita. Le pinzette ottiche intrappolano singole molecole di DNA marcato fluorescentmente e il fluido scorre attraverso la camera e oltre le perle intrappolate, allunga il DNA in forma B (sotto una forza minima, cioè 0 pN) con l'acido nucleico osservato come una stringa bianca su uno sfondo nero. Le molecole di DNA vengono spostate da un flusso all'altro, traslando lo stadio perpendicolarmente al flusso per consentire l'avvio delle reazioni in modo controllato. Per raggiungere il successo, i dispositivi microfluidici con canali otticamente trasparenti sono accoppiati a siringhe di vetro tenute in posizione in una pompa a siringa. I risultati ottimali utilizzano connettori legati in modo permanente alla cella di flusso, tubi meccanicamente rigidi e resistenti agli agenti chimici e collegati a valvole di commutazione che eliminano le bolle che impediscono il flusso laminare.

Introduzione

La capacità di visualizzare le interazioni proteina-DNA a livello di singola molecola e in tempo reale ha fornito informazioni significative sulla stabilità del genoma ^1,2. Oltre a lavorare con singole molecole di DNA una alla volta, la possibilità di visualizzare le transazioni tra singole molecole vicine fornisce ulteriori informazioni ^3,4,5. La manipolazione di ulteriori molecole di DNA richiede sia trappole ottiche aggiuntive che celle a flusso microfluidico multicanale di alta qualità⁶.

Esistono diversi metodi disponibili per generare più di una trappola ottica. Questi includono specchi a scansione galvanometrica, modulatori ottici acustici e ottiche diffrattive, che generano pinzette ottiche olografiche 4,7,8,9. Spesso, specchi a scansione e modulatori ottici acustici producono trappole che multiproprietà. Nella configurazione qui descritta, il fascio di un singolo laser Nd: YAG viene diviso sulla polarizzazione, e quindi gli specchi di scansione laser galvanometrici controllano la posizione di quella che viene definita la trappola mobile (Figura 1) ⁴. Per facilitare il posizionamento di specchi e filtri per dirigere il fascio di intrappolamento verso l'apertura posteriore dell'obiettivo del microscopio, viene utilizzato un laser HeNe. Ciò rende più facile l'allineamento generale in quanto il fascio HeNe è visibile ad occhio nudo, mentre i raggi infrarossi non lo sono. Il fascio HeNe è anche più sicuro da lavorare rendendo il posizionamento di specchi e altri componenti meno stressante. Inizialmente, il percorso del fascio per questo laser è separato dal raggio di 1064 nm, ma viene introdotto nello stesso percorso del fascio e quindi nell'obiettivo del microscopio. Una volta raggiunto l'allineamento fisico, viene eseguito il posizionamento del fascio di 1064 nm sopra il fascio HeNe e questo è facilitato dall'uso di un visualizzatore a infrarossi e vari strumenti di imaging del fascio per visualizzare la posizione e la qualità del fascio. Quindi, viene introdotto l'espansore del fascio e il raggio infrarosso espanso risultante viene allineato sull'apertura posteriore dell'obiettivo. Infine, l'obiettivo viene rimosso e la potenza in ciascun fascio polarizzato viene misurata e regolata utilizzando piastre d'onda λ/2 per essere uguale (Figura 1C). Le misurazioni della potenza vengono eseguite anche una volta restituito l'obiettivo e in genere c'è una perdita di potenza del 53%. C'è, tuttavia, una potenza sufficiente per formare trappole ottiche fisse e mobili stabili nel piano focale (Figura 1D).

Per visualizzare le transazioni del DNA, le celle a flusso microfluidico svolgono un ruolo chiave in quanto consentono misurazioni controllate a livello di singola molecola con un'elevata risoluzione spaziale e temporale (Figura 2). Il termine microfluidica si riferisce alla capacità di manipolare fluidi in uno o più canali con dimensioni comprese tra 5-500 μm^10,11. Il termine flusso si riferisce al fluido effettivo all'interno di un canale e il canale si riferisce al canale fisico in cui si muovono uno o più flussi di fluidi. Il design della cella di flusso a canale singolo ha un canale fisico comune in cui vengono osservate le reazioni e in genere è presente un solo flusso di fluido. Pertanto, questi progetti sono noti come celle di flusso a flusso singolo. Al contrario, le celle a flusso multi-stream sono definite come un dispositivo microfluidico in cui due o più canali di ingresso convergono in un singolo canale fisico comune (Figura 2A). All'interno del canale comune, i flussi fluidi che hanno origine dai singoli canali fluiscono paralleli l'uno all'altro e rimangono separati con una miscelazione minima tra loro che si verifica a causa della diffusione (Figura 2B). Nella maggior parte delle configurazioni sperimentali, una singola pompa spinge i fluidi in ciascun canale alla stessa velocità. Al contrario, quando viene utilizzato lo sterzo di confine, tre o più pompe a controllo indipendente spingono i fluidi attraverso i canali. Tuttavia, ogni pompa funziona a una velocità diversa, ma la portata netta nel canale comune è costante¹². Ciò consente la rapida sostituzione dei componenti del canale principale semplicemente modificando la velocità della pompa.

Oltre al flusso laminare, un altro fattore critico è il profilo di velocità parabolica all'interno del flusso di fluido laminare. La velocità di flusso più elevata si verifica nel mezzo del flusso e la più lenta si verifica vicino alle superfici (Figura 2C)¹³. Questo profilo deve essere considerato per allungare completamente una molecola di DNA che è attaccata a una perla tenuta nel flusso per una visualizzazione precisa del DNA fluorescente e accurate analisi di singole molecole. Qui, il DNA è allungato in forma B e viene tenuto in posizione sotto 0 pN di forza. Per raggiungere questo obiettivo, la messa a fuoco della posizione della trappola ottica dovrebbe essere in una posizione di 10-20 μm dalla superficie inferiore del coperchio (Figura 2D). Bisogna fare attenzione in modo che la molecola di DNA non sia allungata oltre la forma B in quanto ciò può inibire le reazioni enzimatiche. In condizioni tampone tipiche, 1 μm = 3.000 bp di DNA¹⁴. Inoltre, intrappolando 10-20 μm dal vetrino, il complesso del DNA viene posizionato lontano dalla superficie, riducendo così al minimo le interazioni superficiali.

Molti metodi sono stati utilizzati per creare canali di dispositivi microfluidici e questi possono essere fatti in laboratorio o celle di flusso possono essere acquistati da fonti commerciali 6,15,16,17. I materiali ottimali utilizzati per costruire le celle di flusso devono essere meccanicamente rigidi, otticamente trasparenti con bassa fluorescenza e impermeabili ai solventi organici⁶. Spesso, il vetro float borosilicato o la silice fusa vengono utilizzati per fornire un ambiente di flusso stabile per un tempo prolungato adatto per l'intrappolamento ottico, la visualizzazione e il rilevamento della forza. Questi materiali consentono anche l'uso di solventi non acquosi (ad esempio, metanolo spettrofotometrico) per semplificare la bagnatura superficiale e la rimozione delle bolle d'aria e denaturanti (ad esempio, 6M guanidinium cloridrato) o detergenti per pulire la cella di flusso. Infine, i metodi utilizzati per introdurre fluidi nelle celle di flusso variano da complessi sistemi di pompe per vuoto a pompe a siringa singola 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Nell'approccio qui descritto, viene utilizzata una pompa a siringa che può contenere fino a 10 siringhe (Figura 3A). Ciò offre la flessibilità di utilizzare celle di flusso a canale singolo o celle di flusso con più canali di ingresso. Qui, viene utilizzata una cella di flusso a tre canali che viene accoppiata a siringhe tenute in posizione sulla pompa a siringa utilizzando tubi in poli-etere-etere-chetone (PEEK) (Figura 3A-C). Il flusso dei fluidi è controllato da valvole di commutazione a quattro vie e serve quindi a ridurre al minimo l'introduzione di bolle nella cella di flusso (Figura 3A,D). Inoltre, si raccomandano siringhe a tenuta di gas Hamilton con pareti di vetro rigide e stantuffi rivestiti in politetrafluoroetilene (PTFE), in quanto forniscono un movimento eccezionalmente regolare dello stantuffo che è essenziale per ottenere un flusso regolare^14,27.

Nel sistema sperimentale descritto sono state utilizzate celle di flusso con canali di ingresso da due a cinque. Il numero di canali di ingresso è dettato dall'esperimento in corso. Per lo studio di RecBCD e Hop2-Mnd1, due canali di flusso erano sufficienti^14,28. Per l'elicasi, l'enzima è stato legato all'estremità libera del DNA e tradotto in un flusso contenente magnesio e ATP per avviare la traslocazione e lo svolgimento. Per Hop2-Mnd1, il DNA intrappolato otticamente è stato tradotto nel flusso fluido adiacente contenente proteine e tampone ± ioni metallici bivalenti. L'uso di cellule a flusso a tre canali consente di intrappolare il DNA nel flusso 1, tradurre il DNA nel flusso 2 per consentire il legame proteico e quindi di flusso 3 dove è presente ATP, ad esempio, per avviare reazioni. Una variazione di quanto sopra è quella di utilizzare proteine marcate con fluorescenza nel canale 2, che si traduce in un flusso fluido completamente bianco e preclude la visualizzazione del DNA. Quando questa molecola viene tradotta nel flusso 3, sia le proteine che il DNA sono ora visibili quando vengono avviate le reazioni.

L'uso di valvole di commutazione a quattro vie per controllare il flusso del fluido è un componente critico del sistema per eliminare le bolle nelle celle di flusso. Le bolle sono dannose per il flusso stabile del fluido in quanto si contraggono e si espandono in modi imprevedibili con conseguenti rapidi cambiamenti nella velocità del flusso e l'introduzione di turbolenza. Quando le valvole sono posizionate tra siringhe e tubi di ingresso, il percorso del flusso viene scollegato cambiando la posizione della valvola quando le siringhe vengono sostituite. Quando la nuova siringa viene posizionata, lo stantuffo può essere premuto manualmente in modo che vengano espulsi >6 μL (il volume morto della valvola) e questo elimina quasi completamente le bolle.

Il collegamento di connettori alle celle di flusso è spesso la fase limitante nell'uso delle celle di flusso. Descriviamo l'uso di due tipi di connettori: rimovibili noti come press-fit e permanenti (assemblaggi nanoport). I connettori rimovibili sono semplici da aderire a una cella di flusso e diversi tipi di tubi flessibili oltre al PTFE consigliato possono essere testati con questi connettori. Questo è un modo rapido ed economico per testare tubi e connettori senza sacrificare celle di flusso in vetro più costose. Al contrario, i gruppi nanoport sono fissati in modo permanente, resistono a pressioni fino a 1.000 psi, e, nelle nostre mani, il loro uso è limitato a tubi in PEEK di diversi diametri. Questo non è uno svantaggio in quanto viene preferibilmente utilizzato il tubo PEEK. Una singola cella di flusso in vetro con assemblaggi permanenti collegati può essere riutilizzata per più di 1 anno con un uso attento.

Protocollo

1. Allineamento e test della trappola laser con perline di polistirolo

NOTA: per l'installazione, fare riferimento alla Figura 1A,B.

ATTENZIONE: Lo sperimentatore deve indossare occhiali protettivi appropriati o occhiali di sicurezza laser durante l'allineamento del raggio laser. Poiché il sistema di pinzette ottiche qui descritto utilizza sia raggi HeNe che IR, sono necessari due set separati di vetreria di sicurezza laser.

1. Allineamento HeNe Beam
   1. Posizionare tutti i componenti ottici sulla breadboard. Allineare la breadboard in modo che sia il più vicino possibile a un angolo di 90° rispetto al microscopio.
   2. Collegare il tubo di accoppiamento contenente l'obiettivo e la lente telan al microscopio (Figura 1A-11,12).
      NOTA: la lente telan è un sistema di lenti utilizzato per mettere a fuoco l'immagine sul piano dell'immagine intermedio negli oculari.
   3. Accendere il laser HeNe e aprire l'otturatore (Figura 1A-18). Il fascio deve colpire il filtro (Figura 1A-3) ad un'altezza di 54 mm riflettendo il 50% della luce sullo specchio 5 (Figura 1A-5). Il restante 50% del fascio colpisce lo specchio 4 (Figura 1A-4) alla stessa altezza dello specchio 3.
   4. Regolare lo specchio 4 (Figura 1A-4) in modo che il raggio colpisca lo specchio 6 (Figura 1A-6) ad un'altezza di 51 mm.
   5. Regolare lo specchio 6 (Figura 1A-6) in modo che il raggio sia diretto verso lo specchio galvanico inferiore ad un'altezza di 51 mm. La trave che esce dallo specchio galvanico superiore sarà a 57,5 mm.
   6. Regolare lo specchio 3 (Figura 1A-3) in modo che questo raggio colpisca lo specchio 5 (Figura 1A-5) ad un'altezza di 57,5 mm. Una volta riflesso dallo specchio 5, il raggio dovrebbe colpire lo specchio 9 (Figura 1A-9) alla stessa altezza. Il raggio viene efficacemente ricombinato allo specchio 9, passa attraverso l'obiettivo e il sistema di lenti telan sullo specchio 21 (Figura 1A-21), che lo riflette nell'obiettivo.
   7. Posizionare un vetrino pulito per microscopio sul palco del microscopio. Accendere la fotocamera e visualizzare i raggi fissi e di scansione singolarmente sullo schermo. A partire dallo specchio 3, poi 5 e 9, infine 21, eseguire piccole regolazioni per posizionare il fascio fisso al centro dello schermo.
   8. Per garantire che l'angolo del fascio in uscita dallo specchio 21 sia di 90°, modificare l'altezza Z del microscopio e posizionare il raggio ripreso sulle superfici superiore e inferiore del vetrino. Quando sono identici, il raggio è nella posizione corretta, che è perpendicolare al palcoscenico. Otturatore di questo raggio utilizzando l'otturatore 19 (Figura 1A-19).
   9. A partire dagli specchi 4 e 6, eseguire piccole regolazioni per posizionare il fascio fisso al centro dello schermo. Otturatore questo raggio.
2. Allineamento del fascio infrarosso (IR)
   ATTENZIONE: Eseguire tutti i passaggi a bassa potenza laser per motivi di sicurezza.
   1. Regolare la piastra d'onda 14 (Figura 1A-14) per regolare il rapporto tra fasci trasmessi e riflessi divisi sul beam splitter 2 (Figura 1A-2). Il beam splitter 2 riflette la componente s del raggio laser e trasmette la componente p.
   2. Il fascio che passa attraverso 2, colpisce lo specchio 7 (Figura 1A-7), che devia il raggio sullo specchio galvanico inferiore. Dovrebbe seguire il percorso del raggio HeNe sullo specchio 21. Eseguire piccoli movimenti dello specchio 7 per ottenere questo posizionamento.
   3. Regolare lo specchio 2 in modo che il raggio riflesso dallo specchio 2 colpisca lo specchio 10 (Figura 1A-10) ad un'altezza di 57,5 mm.
   4. Il raggio viene riflesso dallo specchio 10 sullo specchio 8 (Figura 1A-8) ad un'altezza di 57,5 mm. Il raggio successivo dovrebbe colpire lo specchio 9 alla stessa altezza. In caso contrario, apportare piccole modifiche agli specchi 10 e 8 come richiesto.
   5. Rimuovere l'obiettivo e posizionare la testa del misuratore di potenza sopra la porta nella torretta dell'obiettivo.
   6. Utilizzare le piastre 14, 15 e 16 (Figura 1A-14,15,16) per regolare la potenza di ciascun raggio laser in modo che siano uguali come mostrato nella Figura 1C.
   7. Posizionare l'espansore del fascio 1 (Figura 1A-1). Regolare il raggio laser espanso in modo che sia circolare senza coma o astigmatismo.
   8. Per testare le trappole ottiche, creare una soluzione di perle di polistirene da 1 μm sospese in acqua. Quindi, posizionare 10 μL di questa soluzione su un vetrino da microscopio, posizionare un coprivetrino sulla parte superiore e sigillare con lo smalto. Posizionare il vetrino sul palco del microscopio e testare le trappole ottiche intrappolando queste perle da 1 μm. Assicurati che le perline siano risucchiate nelle trappole e tenute stabilmente quando il palco viene spostato. L'intrappolamento dovrebbe avvenire in modo altrettanto efficiente da tutti i lati della trappola.

2. Preparazione della camera microfluidica

1. Se la cella di flusso è un dispositivo costruito commercialmente in polidimetilsilossano (PDMS) su un vetrino, procedere al passaggio 3. Se si tratta di un dispositivo di vetro con connettori collegati, procedere al passaggio 4.
2. Se la cella di flusso non dispone di connettori collegati, incollarli prima ai fori di ingresso sul vetrino del microscopio. Vedere il passaggio 3 per la procedura di collegamento dei connettori.

3. Connessioni delle celle di flusso utilizzando una cella di flusso PDMS

NOTA: per l'installazione, fare riferimento alla Figura 2D.

1. Posizionare la cella di flusso su una superficie piana e pulita. Tenere il tubo in PTFE a 3 mm dall'estremità libera con una pinza. Spingere il tubo nella porta preformata (la porta può supportare una pressione di linea di 2 bar).
2. Ripetere questa procedura per ciascuna delle porte rimanenti. Collegare le porte di ingresso alla pompa della siringa e l'uscita a un flacone di scarico (Figura 4A,B).
3. Riempire ogni siringa di vetro con 1 mL di metanolo spettrofotometrico. Collegare ogni siringa a una valvola di commutazione. Assicurarsi che la valvola abbia l'uscita diretta allo spreco e spurgare ogni linea con 50 μL di metanolo (Figura 4C, posizione chiusa).
4. Commutare la posizione di uscita sulla cella di flusso (Figura 4C, posizione aperta). Pompare 800 μL di metanolo attraverso la cella di flusso ad una portata di 100 μL/h per bagnare le superfici ed eliminare le bolle.
5. Il giorno successivo, ripetere questo processo utilizzando 800 μL di acqua ultrapura. La cella di flusso è ora pronta per l'uso.

4. Fissaggio dei connettori dei tubi press-fit

NOTA: per l'installazione, fare riferimento alla Figura 2F.

1. Se è necessario utilizzare connettori per tubi pressabili, rimuovere con cautela il nastro adesivo da un lato del connettore e posizionarlo sopra il foro nel vetrino del microscopio. Premere verso il basso per alcuni secondi. Ripetere il processo per i connettori rimanenti.
2. Posizionare la cella di flusso su una superficie piana e pulita. Tenere il tubo in PTFE a 3 mm dall'estremità libera con una pinza. Spingere il tubo nel foro preformato nella porta e ripetere questa procedura per ciascuna delle porte rimanenti.
3. Collegare i tubi dagli ingressi alle valvole di commutazione. Procedere al passaggio 7.

5. Sequestro delle assemblee permanenti

NOTA: per l'installazione, fare riferimento alla Figura 2A-C.

1. Eseguire l'attacco su una superficie piana pulita o su un collettore personalizzato per mantenere la cella di flusso e i connettori in posizione durante l'incollaggio.
2. Posizionare la cella di flusso su una superficie piana pulita o nella sezione incassata del collettore (Figura 2B). Posizionare una piccola quantità di colla di vetro sul fondo del gruppo e inserire il sigillo.
3. Posizionare il nanoport su uno dei fori di ingresso sul vetrino del microscopio. Spingere delicatamente verso il basso e tenere in posizione senza movimenti laterali. Ripetere il processo per le porte rimanenti.
4. Lasciare asciugare o bloccare in posizione nel collettore. Rimuovere delicatamente la cella di flusso dal collettore e assicurarsi che gli assiemi siano ben allineati con le porte di ingresso nella cella di flusso. Procedere al passaggio 7 quando si è pronti.

6. Connessioni e preparazione delle celle di flusso

NOTA: per l'installazione, fare riferimento alla Figura 4A,B.

1. Posizionare una cella di flusso sul palco del microscopio. Collegare il tubo utilizzando i connettori a tenuta stagna.
2. Riempire ogni siringa di vetro con 1 mL di metanolo spettrofotometrico. Collegare ogni siringa a una valvola di commutazione. Assicurarsi che la valvola abbia l'uscita diretta allo spreco e spurgare ogni linea con 50 μL di metanolo (Figura 4C, posizione chiusa).
3. Commutare la posizione di uscita sulla cella di flusso (Figura 4C, posizione aperta). Pompare 800 μL di metanolo attraverso la cella di flusso ad una portata di 100 μL/h per bagnare le superfici ed eliminare le bolle.
4. Il giorno successivo, ripetere questo processo utilizzando 800 μL di acqua ultrapura. La cella di flusso è ora pronta per l'uso.

7. Controllo del flusso del fluido

1. Ruotare le valvole di commutazione in posizione chiusa (Figura 4C). Rimuovere le siringhe, eliminare l'acqua residua e riempire le siringhe con soluzioni sperimentali, ad esempio perline di DNA; enzima; e ATP. Riportare le siringhe alla pompa e collegarle alle valvole di commutazione.
2. In questa posizione, forzare manualmente gli stantuffi verso il basso di 5-10 μL per rimuovere eventuali bolle. Impostare la posizione della valvola di commutazione su Apri.
3. Utilizzare lo schema di portata per ottenere una velocità di flusso del fluido ottimale per l'intrappolamento e la visualizzazione, come descritto nella Tabella 1. Il flusso ottimale del fluido per l'intrappolamento ottico dovrebbe consentire un intrappolamento stabile delle perle e una volta che il DNA è allungato, dovrebbe essere di forma B (~ 3.000 bp / μm).

8. Intrappolamento di perle di polistirolo con singole molecole di DNA attaccate

1. Con un ingrandimento di 10x, individuare il confine tra i flussi di fluido vicino ai punti di ingresso del canale. Aggiungi olio all'obiettivo 100x e passa all'ingrandimento più elevato.
2. Aprire le persiane per le trappole ottiche (entrambe o una alla volta). I raggi laser focalizzati dovrebbero intrappolare le perline e il DNA dovrebbe allungarsi immediatamente.
3. Una volta che un complesso è stato intrappolato, traslare lo stadio perpendicolarmente al flusso (Figura 3A,C, riquadro). Questo sposterà il complesso intrappolato dalla soluzione di perline di DNA, nel flusso 2. Un'ulteriore traduzione sposterà il complesso nello stream 3.

9. Pulizia della cella di flusso

NOTA: eseguire questa operazione ogni giorno.

1. Spegnere la pompa al termine dell'esperimento. Ruotare le valvole di commutazione in posizione chiusa (Figura 4C).
2. Rimuovere le siringhe e svuotarle. Risciacquare tre volte con acqua distillata filtrata.
3. Riempire le siringhe con una soluzione detergente. Posizionare le siringhe nella pompa e collegarle alle valvole di commutazione.
4. Spurgo le valvole di commutazione e cambia la posizione per aprire. Pompare 800 μL di soluzione detergente ad una portata di 100 μL/h tipicamente durante la notte.
5. Il giorno successivo, chiudere le valvole di commutazione, quindi rimuovere e sciacquare le siringhe con acqua. Risciacquare la cella di flusso e le linee con 4-800 μL di acqua ad una portata di 400-800 μL/h. Se è necessaria una pulizia più faticosa delle celle di flusso, sostituire la soluzione detergente con 6 M guanidium hydrochloride.

Risultati

Il test iniziale dell'allineamento e della resistenza della trappola viene eseguito con perle di polistirene non fluorescente da 1 μm. Poiché la maggior parte della ricerca condotta in laboratorio utilizza la fluorescenza, testiamo ulteriormente la resistenza della trappola utilizzando perline di polistirene verde drago da 1 μm (Figura 1D, E). Successivamente il lavoro cambia l'intrappolamento ottico dei complessi DNA-perline in cui il DNA viene colorato con il colorante ...

Discussione

L'assemblaggio accurato del sistema di flusso è fondamentale per il buon esito degli esperimenti ^4,6. Uno degli aspetti più impegnativi del protocollo è il fissaggio dei connettori alla superficie del vetro. Per questo, utilizziamo i seguenti due approcci: connettori per tubi press-fit e assemblaggi nanoport. I connettori press-fit aderiscono facilmente al vetro seguiti dalla spinta dei tubi in PTFE nei fori preformati utilizzando una pinza. Quando è richiest...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x objective	Leica	506318 or 506038	Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging
10X Objective	Leica	506263	Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell
1 mm fluorescent beads	Bangs Labs	FSDG004	Used for tap performance, focal position determination
1 mm polystyrene beads	Bangs Labs	CPO1004	Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules
63x objective	Leica	506081	Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens
Alignment laser	Lumentum	1100 series	10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics
Beam alignment camera	Amscope	MU303	A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position
Camera control and Image capture software	Hamamatsu	HCImage	Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching
Camera; Orca flash 4	Hamamatsu	c13440-20cu	CCD camera for imaging of single-molecule experiments
C-mount for the beam alignment camera	Spot imaging solutions	DE50CMT	Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment
C-mount for the Orca Flash 4 camera			Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.
Cy5  fluorescence filter cube	Semrock	cy5-404a-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only
Fitc-Txred  fluorescence filter cube	Semrock	fitc/txred-2x-b-000	Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed
Fluidics tubing	Grace Bio	46004	PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used
GFP fluorescence filter cube	Semrock	gfp-3035b-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only
Glass flow cells	Translume	Custom	Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)
Glass glue	Loctite	233841	Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells
Glass/PDMS sandwich flow cells	CIDRA Precision services	Custom design	Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)
Hamilton Cleaning solution	Hamilton	18311	Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully
Illumination system	Sutter Instrument	Lamda DG4	Discontinued so recommend Lambda 721
Illumination system	Sutter Instrument	Lamda DG4	Discontinued so recommend Lambda 721
Image analysis software	Media cybernetics	Image Pro Premiere	Analysis of images and single molecule tracking
Image analysis software	Fiji/NIH Image/Image J	Shareware	Analysis of images and single molecule tracking
Image display card	Melles Griot	06 DLA 001	Alternate product from Thorlabs: VRC5
Immersion oil	Zeiss	444960	Immersol 518 F fluorescence free
Laser beam alignment tools	Thor labs	FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1	Used to ensure beams are horizontal and at the correct height
Laser beam viewer	Canadian Photonics labs	IR 3150	Used to image IR beam spots on mirrors and  targets
Laser power meter	Thor labs		Measurement of laser output as well as trap strength
Laser safety glasses (HeNe)	Thor labs	LG7 or 8	Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm
Laser safety glasses (IR)	Thor labs	LG11	Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm
Mcherry  fluorescence filter cube	Semrock	mcherry-a-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only
Microscope	Leica	DMIRE2	DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror
Microscope control software	UCSF/shareware	uManager	Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control
Nanoport assembly	IDEX	N333	Connectors that are bonded to flow cells
Optical table support	Thor Labs	PA52502	Active isolation table support
Optics and lenses	Solar TII	Various	Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system
PDMS flow cells	ufluidix	Custom	Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)
PEEK tubing	IDEX	1532	Provides excellent connection to flow cells and switching valves
Pinkel fluorescence filter cube	Semrock	lf488/543/635-3x-a-000	Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly
Press fit tubing connectors	GraceBio	46003	Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass
Scanning mirrors	GSI Lumonics	VM500	Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific
Stage	Leica
Stage micrometer	Electron Microscopy Sciences	68042-08	Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration
Switching valves	IDEX	V-101T	Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells
Syringe and valve manifold	Machine shop	None	Custom built
Syringe pump	Harvard Apparatus	PHD 2000	Controls fluid flow through flow cells
Syringe pump software	Harvard Apparatus	70-6000	Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow
Syringes	Hamilton	81320	Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers
Table top	Thor Labs	T36H	Optical table top or breadboard
Trapping laser	Newport/Spectra Physics	J-series; BL106C	Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser