Saggio gravitazionale su larga scala delle larve di Caenorhabditis dauer

Riepilogo

Il presente protocollo delinea i metodi per condurre un test gravitazionale su larga scala con larve di Caenorhabditis dauer. Questo protocollo consente una migliore rilevazione del comportamento della gravitassi rispetto a un test basato su piastra.

Abstract

La sensazione di gravità è un processo importante e relativamente poco studiato. Il rilevamento della gravità consente agli animali di navigare nell'ambiente circostante e facilita il movimento. Inoltre, la sensazione di gravità, che si verifica nell'orecchio interno dei mammiferi, è strettamente correlata all'udito - quindi, la comprensione di questo processo ha implicazioni per la ricerca uditiva e vestibolare. Esistono saggi di gravitassi per alcuni organismi modello, tra cui Drosophila. I singoli vermi sono stati precedentemente analizzati per la loro preferenza di orientamento mentre si depositano in soluzione. Tuttavia, non è stato descritto un test affidabile e robusto per Caenorhabditis gravitaxis. Il presente protocollo delinea una procedura per l'esecuzione di saggi di gravitasi che possono essere utilizzati per testare centinaia di caenorhabditis alla volta. Questo test su larga scala e a lunga distanza consente una raccolta dettagliata dei dati, rivelando fenotipi che potrebbero non essere rilevati in un test standard basato su piastra. Il movimento Dauer lungo l'asse verticale viene confrontato con i controlli orizzontali per garantire che la polarizzazione direzionale sia dovuta alla gravità. La preferenza gravitattica può quindi essere confrontata tra ceppi o condizioni sperimentali. Questo metodo può determinare i requisiti molecolari, cellulari e ambientali per la gravitassi nei vermi.

Introduzione

Percepire l'attrazione gravitazionale della Terra è cruciale per l'orientamento, il movimento, la coordinazione e l'equilibrio di molti organismi. Tuttavia, i meccanismi molecolari e i neurocircuiti della sensazione di gravità sono poco compresi rispetto ad altri sensi. Negli animali, la sensazione di gravità interagisce e può essere superata da altri stimoli per influenzare il comportamento. Segnali visivi, feedback propriocettivi e informazioni vestibolari possono essere integrati per generare un senso di consapevolezza del corpo rispetto all'ambiente circostante di un animale ^1,2. Al contrario, la preferenz....

Protocollo

I ceppi utilizzati nel presente studio sono C. elegans (N2) e C. briggsae (AF16) (vedi tabella dei materiali). Per ogni test è stata utilizzata una popolazione mista di dauers.

1. Preparazione della camera

1. Lavora in una cappa aspirante. Impostare l'area di lavoro con un bruciatore Bunsen, 1-2 lamette da barba, pinze, pinzette e una superficie di taglio in plastica (vedere Tabella dei materiali).
2. Per ogni camera, raccogliere due pipette sierologiche da 5 ml. Rimuovere il tappo di cotone da una pipetta con una pinzetta. Tenere una lametta sul bruciatore B....

Risultati

Confronto tra gravitassi tra specie
Seguendo la procedura sopra descritta, C. briggsae dauer gravitaxis può essere confrontato con C. elegans gravitaxis e controlli orizzontali. La distribuzione verticale (marrone) dei dauers di C. briggsae è inclinata verso le sommità delle camere, con una grande percentuale di vermi che raggiunge +7 (Figura 2A). In contrasto con i controlli orizzontali (aqua), in cui i dauers sono distribuiti in una curva a.......

Discussione

Confronto con i metodi precedenti
A differenza della chemiotassi, la gravitassi in Caenorhabditis non può essere osservata in modo affidabile utilizzando un tradizionale progetto sperimentale di piastra di agar. Una capsula di Petri standard ha un diametro di 150 mm, risultando in soli 75 mm disponibili in entrambe le direzioni per i dauers per dimostrare la preferenza per la gravitaxi. Sebbene la preferenza orientativa di C. elegans possa essere saggiata nella soluzione

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Sodium Dodecyl Sulfate solution			From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes	Falcon	14-959-53A
3 mm Hex key			Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L			Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes	Fisherbrand	S68228C	Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution			60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap	Fisherbrand	22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades	Fisherbrand	12-640
Faraday cage			Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers			Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape	Carolina	215620
M9 buffer			22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50			1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film	Bemis	13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer	BTLab SYSTEMS	BT913	With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor	Corning	357469
Stereo Microscope	Laxco	S2103LS100
Tally counter	ULINE	H-7350
Thick NGM/agar plate media - 1 L			See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers