Nozioni di base sull'istologia e rilevamento della morte cellulare nel tessuto delle api

Riepilogo

I metodi immunoistochimici sono utili nella ricerca sulle api per rilevare e valutare il livello di apoptosi e necrosi nell'intestino medio e nelle ghiandole ipofaringee delle api adulte.

Abstract

Le api mellifere (Apis mellifera L.) all'interno dell'alveare (lavoratrici nutrici e altre api dell'alveare) e all'esterno dell'alveare (raccoglitrici) sono esposte ai cambiamenti climatici e climatici, vari pesticidi, agenti patogeni e malnutrizione, entrando principalmente attraverso la bocca e colpendo principalmente i tratti digestivi delle api adulte. Per comprendere e prevenire gli effetti di tali fattori di stress esterni e interni sulle api, un utile metodo di ricerca è il metodo immunoistochimico. Viene descritto un protocollo di base per preparare l'intestino medio (ventricolo) e le ghiandole ipofaringee (HPG) delle api adulte per l'analisi istologica. Viene descritta una metodologia dettagliata per valutare il livello di danno cellulare e distinguere la necrosi dalla morte cellulare programmata (apoptosi) come processo naturale di rigenerazione dei tessuti. Vengono presentati i risultati del trattamento delle api adulte con acido ossalico e pesticidi (insetticida e acaricida) e la determinazione della morte cellulare nel ventricolo e negli HPG. Vengono inoltre discussi i pro e i contro della metodologia.

Introduzione

Le api mellifere (Apis mellifera L.) sono, tra gli altri impollinatori selvatici, i più importanti impollinatori delle piante agricole. Nel corso di migliaia di anni, l'ambiente mutevole ha influenzato le api ad adattare la loro morfologia, fisiologia, comportamento e tolleranza a diversi agenti patogeni e parassiti. Pertanto, le api hanno sviluppato una gamma molto diversificata di specie e sottospecie in tutto il mondo¹. Questi risultati sono coerenti con i risultati precedenti, che c'è una variazione genetica nella struttura del tratto digestivo dell'ape, ma suggeriscono anche che le alterazioni dell'intestino medio sono dovute a fa....

Protocollo

1. Istologia di base per la ricerca sulle api

1. Dissezione del tessuto delle api
   NOTA: Per la dissezione delle api operaie, utilizzare un microscopio da dissezione con una sorgente luminosa a LED. L'ingrandimento più utile è ~ 20x.
   1. Manipolazione e dissezione
      1. Prendere con cautela un'ape operaia con una pinza e metterla sul ghiaccio (o nel congelatore a -20 ° C) per 2 minuti per immobilizzarla²². Appuntare l'ape sulla piastra di Petri diagonalmente attraverso la parte posteriore superiore del torace due volte, da sinistra a destra e da destra a sinistra.
      2. Versare soluzione salina per insetti pe....

Risultati

Rilevamento della morte cellulare nel midgut
Le api operaie appena emerse (Apis mellifera carnica) dall'apiario sperimentale dell'Istituto agricolo sloveno di Lubiana sono state trattate individualmente con acido ossalico (OA^{) al} 3%. L'OA è spesso usato in apicoltura per il controllo del distruttore di Varroa . Dopo il trattamento, le api operaie (tre per ogni gruppo) sono state immobilizzate sul ghiaccio. Il midgut è stato sezionato e fissato in formalina a.......

Discussione

Negli organismi viventi, la morte cellulare è definita come apoptosi o necrosi²⁵ e può essere accompagnata da autofagia²⁶. La differenza tra cellule apoptotiche e necrotiche è che l'apoptosi è una forma di morte cellulare programmata e appare nelle cellule normali, mentre la necrosi si verifica a causa di condizioni letali (ad esempio, incidente, malattia)^27,28. L'apoptosi può essere rilevata utilizzando kit di.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol
ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection)	Sigma-Aldrich	S7100	Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101
Covers
DeadEnd Colorimetric TUNEL system	Promega	G7360	Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360
Dissecting microscope  (for bee dissection)	Zeiss
Distilled water
Embedding cassette
EnVision System alkaline phosphatase kit	Dako
Eosin Y Solution	Sigma-Aldrich		alcoholic
Ethanol			95% (or less pure), 90%, 80%
Faramount mounting medium, aqueous	Dako		mounting medium
Flattening table	Leica	HI1220
Forceps  (for bee dissection)	Fine science tools	11294-00	Standard #4
Formalin 10%			Formaldehyde
Hematoxylin	Sigma-Aldrich
HistoChoice Clearing Agent	Sigma-Aldrich		clearing agent
Hydrogen peroxidase 3%
Incubator	BioRad
Insect pins  (for bee dissection)	Entosphinx	44594	Insect pins stainless steel – white, size 2
ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase)	Roche	11684809910	Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf
KH2PO4
Lab clock
Light microscope	Leica
Microscope slides			Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust
Microtome	Leica
Modular tissue embedding station	Leica
Na2HPO4
NaCl
Paraformaldehyde 4%
Paraplast	Leica
Pasteur pipettes			1.5 mL; 3 mL
PBS
Petri dish  (for bee dissection)			Filled with condensation silicon  (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator)
Proteinase K	Merck	21627
Ringers' solution  (for bee dissection)			7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water
Scissors  (for bee dissection)	Fine science tools	1406-09, 14061-09	Straight and curved, 9 cm
Universal liquid plus activator  (for bee dissection)	Kulzer
Watchmaker’s forceps (for bee dissection)	Fine science tools	91100-12
Water bath	Leica
Watercolor brush			2x
Xantoprene L blue  (for bee dissection)	Kulzer