Visualizzazione della dinamica conformazionale dei recettori di membrana utilizzando FRET a singola molecola

Riepilogo

Questo studio presenta una procedura dettagliata per eseguire esperimenti di trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola (smFRET) sui recettori accoppiati a proteine G (GPCR) utilizzando la marcatura sito-specifica tramite incorporazione di amminoacidi innaturali (UAA). Il protocollo fornisce una guida passo-passo per la preparazione dei campioni smFRET, gli esperimenti e l'analisi dei dati.

Abstract

La capacità delle cellule di rispondere ai segnali esterni è essenziale per lo sviluppo, la crescita e la sopravvivenza cellulare. Per rispondere a un segnale proveniente dall'ambiente, una cellula deve essere in grado di riconoscerlo ed elaborarlo. Questo compito si basa principalmente sulla funzione dei recettori di membrana, il cui ruolo è quello di convertire i segnali nel linguaggio biochimico della cellula. I recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) costituiscono la più grande famiglia di proteine recettoriali di membrana nell'uomo. Tra i GPCR, i recettori metabotropici del glutammato (mGluR) sono una sottoclasse unica che funziona come dimeri obbligati e possiede un ampio dominio extracellulare che contiene il sito di legame del ligando. I recenti progressi negli studi strutturali dei mGluR hanno migliorato la comprensione del loro processo di attivazione. Tuttavia, la propagazione di cambiamenti conformazionali su larga scala attraverso mGluR durante l'attivazione e la modulazione è poco conosciuta. Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola (smFRET) è una tecnica potente per visualizzare e quantificare la dinamica strutturale delle biomolecole a livello di singola proteina. Per visualizzare il processo dinamico di attivazione di mGluR2, sono stati sviluppati sensori conformazionali fluorescenti basati sull'incorporazione di amminoacidi innaturali (UAA) che hanno permesso la marcatura proteica sito-specifica senza perturbazioni della struttura nativa dei recettori. Il protocollo qui descritto spiega come eseguire questi esperimenti, incluso il nuovo approccio di etichettatura UAA, la preparazione del campione e l'acquisizione e l'analisi dei dati smFRET. Queste strategie sono generalizzabili e possono essere estese per studiare le dinamiche conformazionali di una varietà di proteine di membrana.

Introduzione

Il trasferimento di informazioni attraverso la membrana plasmatica dipende fortemente dalla funzione dei recettori di membrana¹. Il legame del ligando a un recettore porta a un cambiamento conformazionale e all'attivazione del recettore. Questo processo è spesso di natura allosterica². Con oltre 800 membri, i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono la più grande famiglia di recettori di membrana nell'uomo³. A causa del loro ruolo in quasi tutti i processi cellulari, i GPCR sono diventati obiettivi importanti per lo sviluppo terapeutico. Nel modello canonico di segnalazione GPCR, l'attivazion....

Protocollo

Il flusso di lavoro complessivo del protocollo è descritto nella Figura 1.

1. Preparazione della camera di campionamento

1. Pulizia vetrini e coprivetrini
   NOTA: Questi passaggi mirano a pulire le superfici dei vetrini e dei vetrini e prepararli per l'aminosilanizzazione. Un requisito critico per condurre esperimenti di fluorescenza a singola molecola su molecole legate alla superficie è una superficie passivata. La tecnica di passivazione più affidabile e riproducibile consiste nell'attaccare covalentemente catene polimeriche inerti alla superficie del vetro come uno strato denso. Il glicole polie....

Risultati

Espressione ed etichettatura fluorescente di sensori FRET basati su UAA
Qui^{vengono discussi} i risultati esemplari dell'inserimento e dell'etichettatura fluorescente di una UAA (AZP) all'interno del CRD di mGluR2 (548UAA). Come accennato in precedenza, per inserire AZP in mGluR2, è necessaria la co-espressione del macchinario traslazionale ingegnerizzato, che include una tRNA sintetasi modificata e tRNA complementare (pIRE4-Azi), e mGluR2 contenente un codone ambrato in posizio.......

Discussione

I GPCR sono proteine che operano sulla membrana cellulare per avviare la trasduzione del segnale. Molti GPCR sono costituiti da più domini, con la segnalazione dipendente dall'interazione cooperativa tra i domini. Per modulare le proprietà di questi recettori di membrana, è essenziale comprendere il comportamento dinamico dei molteplici domini. Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola (smFRET) è una tecnica di fluorescenza che consente la misurazione della conformazione e della dina.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
(+)-Sodium L-Ascorbate	Sigma Aldrich	Cat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanine	Chem-Impex International	Cat # 06162
548UAA	Liauw et al. 2021		Transfected construct
Acetic Acid	Fisher Chemical	64-19-7
Acetone	Fisher Chemical	67-64-1
Adobe Illustrator (2022)	https://www.adobe.com/	RRID:SCR_010279	Software, algorithm
Aminoguanidine (hydrochloride)	Cayman Chemical	81530
Aminosilane	Aldrich	919-30-2
Bath Sonicator 2.8 L	Fisher Scientific		Ultrasonic Bath 2.8 L
Biotin-PEG	Laysan Bio Inc	Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES	Click Chemistry Tools	1237-500
Copper (II) sulfate	Sigma Aldrich	Cat # 451657-10G
Cover slip	VWR	16004-306	Sample chamber
Cy3 Alkyne	Click Chemistry Tools	TA117-5
Cy5 Alkyne	Click Chemistry Tools	TA116-5
DDM	Anatrace	Part# D310 1 GM	Detergent
DDM-CHS (10:1)	Anatrace	Part# D310-CH210 1 ML	Detergent with cholecterol
Defined Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	SH30070.03
Di01-R405/488/561/635	Semrock		Notch filter
DMEM	Corning	10-013-CV
EMCCD	Andor	DU-897U	Camera
ET542lp	Chroma		Long pass emission filter
FF640-FDi01	Semrock		Emission dichroic filter
FLAG-tag antibody	Genscript	A01429
Fluorescent bead	Invitrogen T7279	TetraSpeck microspheres	Spherical bead
Glass slides	Fisherfinest	12-544-4	sample chamber
Glutamate	Sigma Aldrich	Cat # 6106-04-3
HEK 293T	Sigma Aldrich	Cat # 12022001	Cell line
HEPES	FisherBioReagents	7365-45-9
Image splitter	OptoSplit II
KOH	Fluka	1310-58-3
Laser	Oxxius		4-line laser combiner
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000015	Transfection Reagent
Methanol	Fisher Chemical	67-56-1
Microscope	Olympus	Olympus IX83
Milli-Q water	Barnstead		Water Deionizer
m-PEG	Laysan Bio Inc	Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635	Semrock		Dichroic mirror
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	51985091	Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b)	https://www.originlab.com/	RRID:SCR_014212	Data analysis and graphing software
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
pIRE4-Azi	Addgene	Plasmid # 105829	Transfected construct
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma Aldrich	Cat # P2636
Protocatechuic acid (PCA)	HWI group	99-50-3
smCamera (Version 1.0)	http://ha.med.jhmi.edu/resources/		Camera software
Sodium bicarbonate	FisherBioReagents	144-55-8
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma	1310-73-2
Syringe filter	Whatman UNIFLO	Cat#9914-2502	Liquid filtration
Trolox	Sigma	53188-07