Un dispositivo di terapia fotodinamica costruito internamente e basato su diodi emettitori di luce per migliorare la citotossicità delle verteporfine in un modello di coltura cellulare 2D

Riepilogo

Qui, descriviamo un dispositivo nuovo, semplice e a basso costo per eseguire con successo saggi di terapia fotodinamica in vitro (PDT) utilizzando colture cellulari HeLa bidimensionali e verteporfina come fotosensibilizzante.

Abstract

Questo documento descrive un dispositivo nuovo, semplice e a basso costo per eseguire saggi di terapia fotodinamica in vitro (PDT), chiamato PhotoACT. Il dispositivo è stato costruito utilizzando una serie di diodi emettitori di luce programmabili convenzionali (LED), un modulo display a cristalli liquidi (LCD) e un sensore di luce collegato a una scheda microcontroller commerciale. La struttura scatolare del prototipo è stata realizzata con pannelli di fibra a media densità (MDF). Il compartimento interno può allocare contemporaneamente quattro micropiastre multipozzetto per colture cellulari.

Come prova di concetto, abbiamo studiato l'effetto citotossico della verteporfina fotosensibilizzatrice (PS) contro la linea cellulare HeLa in coltura bidimensionale (2D). Le cellule HeLa sono state trattate con concentrazioni crescenti di verteporfina per 24 ore. Il mezzo di supernatante contenente farmaco è stato scartato, le cellule aderenti sono state lavate con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ed è stato aggiunto terreno privo di farmaci. In questo studio, l'effetto della verteporfina sulle cellule è stato esaminato senza esposizione alla luce o dopo l'esposizione per 1 ora alla luce utilizzando valori rosso-verde-blu (RGB) di 255, 255 e 255 (fluenza media di 49,1 ± 0,6 J / cm²). Dopo 24 ore, la vitalità cellulare è stata valutata mediante il test 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT).

I risultati sperimentali hanno mostrato che l'esposizione delle cellule trattate con verteporfina alla luce del dispositivo aumenta l'effetto citotossico del farmaco attraverso un meccanismo mediato da specie reattive dell'ossigeno (ROS). Inoltre, l'uso del prototipo descritto in questo lavoro è stato convalidato confrontando i risultati con un dispositivo PDT commerciale. Pertanto, questo prototipo di terapia fotodinamica basata su LED rappresenta una buona alternativa per gli studi in vitro di PDT.

Introduzione

Tra le malattie non trasmissibili più letali, il cancro rappresenta una delle principali cause globali di morte prematura. Ha rappresentato quasi 10 milioni di morti nel 2020, rappresentando circa un decesso su sei in tutto il mondo¹. Inoltre, il fenomeno della resistenza multifarmaco (MDR) rappresenta una tremenda minaccia per la salute pubblica, poiché i protocolli chemioterapici approvati non riescono a raggiungere le fasi di remissione per questa condizione clinica². Le cellule tumorali possono sviluppare resistenza alla chemioterapia attraverso diversi meccanismi; tuttavia, la sovraespressione di alcuni trasportatori di cassette leganti ATP (ABC) - pompe di efflusso ATP-dipendenti - è considerata la causa principale dello sviluppo di MDR all'interno di un microambiente tumorale³. Oltre all'MDR, altre complicanze del cancro, come la recidiva e le metastasi, rafforzano l'urgente richiesta di sviluppare e migliorare gli approcci terapeutici per superare questa sfida oncologica.

L'utilizzo curativo della luce è stato praticato per secoli⁴ e la terapia fotodinamica (PDT) rappresenta un approccio terapeutico clinicamente approvato per i tumori solidi. La PDT combina la somministrazione di un fotosensibilizzatore (PS) seguita da irradiazione luminosa per generare specie reattive dell'ossigeno (ROS) per esercitare citotossicità selettiva nelle cellule tumorali. Questo approccio terapeutico è superiore ai metodi convenzionali, tra cui chirurgia, radioterapia e chemioterapia⁵; È una tecnica minimamente invasiva che mostra una minore citotossicità nei tessuti connettivi⁶. L'applicazione della luce e l'accumulo di PS direttamente nel tumore o nel suo microambiente assicurano un targeting preciso e, di conseguenza, effetti collaterali sistemici minori e indesiderati⁷ e la possibilità di ripetere il trattamento nella stessa sede. Inoltre, il costo è inferiore a quello di altri approcci. Per le sue caratteristiche promettenti, la PDT può essere considerata un'opzione appropriata sia per il trattamento del cancro singolo, soprattutto nel caso di tumori inoperabili, sia per il trattamento adiuvante del cancro⁷, e rappresenta un'alternativa per MDR correlato alla chemioterapia ^8,9.

Il primo rapporto che mostrava un alto tasso di risposta obiettiva usando PDT è stato descritto nel 1975 in un modello di topo e ratto¹⁰. Da allora, sono stati condotti studi utilizzando PDT con esiti positivi⁷ sia in vivo che in vitro con linee cellulari tumorali umane in coltura cellulare 2D^11,12. Considerando l'ampia applicabilità della PS clinicamente approvata, indipendentemente dalle loro specifiche vie di accumulo e dagli intervalli di lunghezze d'onda dei picchi di assorbimento, il processo generale è il seguente: (i) assorbimento di PS, (ii) picco della concentrazione di PS nel tumore o nel suo microambiente, (iii) applicazione della luce, (iv) interazione PS-luce, (v) trasferimento di energia allo stato eccitato di PS al substrato tissutale o alle molecole di ossigeno circostanti, (vi) produzione di ROS che coinvolge ossigeno singoletto o anione superossido, (vii) morte delle cellule tumorali attraverso, essenzialmente, necrosi o apoptosi (morte diretta), autofagia (meccanismo citoprotettivo), ischemia tissutale (danno vascolare), modulazione immunitaria o una sovrapposizione di questi meccanismi⁷. In questa fase finale, l'attivazione di una specifica via di morte cellulare dipende da molti fattori, come le caratteristiche cellulari, il disegno sperimentale e, soprattutto, la localizzazione intracellulare della PS e il danno mirato correlato alla PDT¹³.

La verteporfina è una PS di seconda generazione, approvata dalle agenzie regolatorie per uso clinico in Norvegia e Cina per il trattamento della degenerazione maculare legata all'età⁷. Dopo la somministrazione della dose, è stato riportato che questo profarmaco si accumula parzialmente nei mitocondri¹⁴ e induce la fosforilazione della tirosina proteica cellulare e la frammentazione del DNA, portando all'apoptosi delle cellule tumorali^15,16. Dopo 24 ore di incubazione per l'internalizzazione delle verteporfine, si raccomanda un protocollo PDT che utilizza una configurazione di lunghezza d'onda di 690 nm per ottenere livelli efficaci di trasferimento di radiazione elettromagnetica alle molecole adiacenti ^7,17.

Per quanto riguarda la sorgente luminosa per PDT, i classici sistemi laser a diodi sono solitamente costosi, tecnicamente complicati, sovradimensionati e quindi non portatili^18,19. Come conseguenza del suo profilo a lunghezza d'onda singola, che può essere osservato anche nelle apparecchiature PDT basate su LED, la richiesta di unità indipendenti per ogni applicazione di fotosensibilizzatori rende l'utilizzo di sistemi laser a diodi ancora più complesso ed economicamente impraticabile^20,21. Pertanto, l'utilizzo di macchinari a LED è considerato l'alternativa più promettente per risolvere non solo i costi²² e problemi di manutenzione, ma anche per fornire un'elevata potenza e meno dannosa 23 e una più ampia capacità di illuminazione 24,25,26,27.

Nonostante il potenziale contributo che le apparecchiature basate su LED possono offrire agli esperimenti PDT²⁸, la maggior parte delle opzioni commerciali presenta ancora inconvenienti come la mancanza di portabilità, costi elevati e complessi progetti di costruzione e funzionamento²⁹. L'obiettivo principale di questo lavoro era quello di offrire uno strumento semplice e affidabile per i saggi PDT in vitro . Questo documento descrive PhotoACT, un dispositivo PDT basato su LED costruito internamente, che è economico, facile da usare e portatile. Come prova di concetto, questo dispositivo ha dimostrato di migliorare la citotossicità della verteporfina in un modello di coltura cellulare 2D e, pertanto, può essere utilizzato come strumento di ricerca negli esperimenti PDT.

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Protocollo

NOTA: vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e il software utilizzati in questo protocollo.

1. Costruzione del dispositivo

1. Segare pannelli di fibra a media densità (MDF) spessi 3 mm per ottenere pezzi con le dimensioni mostrate in Figura 1A.
   NOTA: utilizzare il file vettoriale (file supplementare 1) per il taglio a controllo numerico computerizzato (CNC).
2. Costruire due scatole con le seguenti dimensioni (lunghezza x larghezza x altezza): 330 mm x 235 mm x 225 mm per le scatole più grandi e 300 mm x 220 mm x 150 m per le scatole più piccole (Figura 1B).
3. Forare il retro della scatola più grande per installare un connettore jack barile. Forare la parte superiore della scatola più grande e la parte superiore e inferiore della scatola più piccola per fornire un passaggio per i cavi elettrici (Figura 1C).
4. Dipingete tutte le superfici interne con inchiostro nero per favorire un'incidenza omogenea della luce (Figura 1D).
5. Attaccare, in parallelo, tre nastri LED con 10 LED ciascuno sulla superficie interna superiore della scatola più piccola (Figura 1E).
6. Installare un sensore di luminosità al centro della superficie interna inferiore della scatola più piccola (Figura 1F).
7. Stampare la struttura dell'unità di controllo (Figura 1G) utilizzando il file di stampa 3D (file supplementare 2).
8. Installare tutti i componenti (pulsante di accensione, potenziometri, touchpad tempo/avvio, LED, sensore di luminosità, LCD, cicalino e alimentatore) alle porte di una scheda di controllo ESP32 montata all'interno dell'unità di controllo (Figura 2).
9. Caricare il codice di programmazione (file supplementare 3, file supplementare 4 e file supplementare 5) ed eseguire un test per verificare che tutte le connessioni funzionino (Figura 1H).
10. Assemblare le scatole e fissarle insieme per evitare spazi vuoti, e di conseguenza interferenze luminose esterne e perdite di luce emesse. Collegare l'unità di controllo montata all'area forata nella parte superiore del prototipo (Figura 1I).
11. Fissare una porta anteriore dello stesso materiale e dimensioni 330 mm x 225 mm (lunghezza x larghezza) sulla scatola più grande con due cerniere piccole. Inoltre, attaccare i nastri in velcro lateralmente alla scatola più grande per rinforzare la chiusura del prototipo (Figura 1J). Installare una maniglia per manipolare la porta anteriore dell'apparecchiatura.
12. Fissare quattro piedini in gomma nella parte inferiore del prototipo per garantire una maggiore stabilità durante le operazioni (Figura 1K).

2. Linee cellulari: coltivazione, semina e trattamento

1. Prodotti chimici
   1. Sciogliere la porfirina in dimetilsolfossido (DMSO) per ottenere una concentrazione di 100 mM.
      ATTENZIONE: il DMSO deve essere manipolato con attenzione (manipolazione con l'uso di dispositivi di protezione individuale e in un'area ventilata). Manipolare accuratamente sia le soluzioni grezze che quelle diluite per evitare un'eccessiva esposizione alla luce.
2. Linee cellulari
   1. Coltivare la linea cellulare HeLa nel mezzo a basso contenuto di glucosio Modified Eagle's Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale e l'1% di gentamicina.
   2. Conservare i palloni di coltura in un incubatore per colture cellulari al 5% di CO₂ a 37 °C.
   3. Gestire e ispezionare le celle fino a raggiungere l'80% -90% di confluenza.
3. Processo di semina
   1. Rimuovere il terreno di coltura dal pallone.
   2. Lavare il monostrato cellulare con PBS.
   3. Staccare la coltura cellulare confluente con tripsina-EDTA (0,5%) 1x per 5 minuti a 37 °C. Interrompere l'azione della tripsina risospendendo le cellule con terreno di coltura integrato con siero bovino fetale al 10% e gentamicina all'1%.
   4. Contare le cellule risospese con un emocitometro e seminarle in una piastra a 96 pozzetti a 2,0 × 10⁴ cellule / pozzetto.
   5. Preparare due piastre per condizioni di buio e luce.
   6. Incubare le piastre per 24 ore per l'attacco cellulare.
4. Processo di trattamento
   1. Rimuovere il mezzo da entrambe le piastre a 96 pozzetti.
   2. Trattare le cellule con 100 μL di concentrazioni crescenti di verteporfina (da 0,045 a 24 μM, diluizione seriale).
   3. Incubare le cellule con un trattamento farmacologico per 24 ore per consentire l'internalizzazione delle verteporfine.
   4. Dopo 24 ore, scartare il mezzo contenente il farmaco, lavare il monostrato di cellule con PBS (100 μL) e aggiungere terreno senza farmaco (100 μL).
   5. Coprire una micropiastra con un foglio di alluminio per proteggerla dall'esposizione alla luce e incubarla per 24 ore. Questa piastra fornirà i dati di controllo per i risultati PDT (condizione di buio). L'altra micropiastra verrà utilizzata sulla condizione di esposizione alla luce nel dispositivo.

3. Funzionamento del dispositivo

1. Collegare il dispositivo PDT alla presa elettrica e accenderlo premendo il pulsante di accensione .
2. Posizionare l'altra micropiastra (condizione di luce) nel dispositivo PDT e chiudere l'apparecchiatura fissando la porta anteriore con i nastri in velcro.
3. Utilizzare i potenziometri per regolare la configurazione RGB (un esperimento RGB 255, 255 , 255 qui) e impostare il colore dell'emissione luminosa.
   NOTA: Ogni combinazione RGB ha uno spettro di emissione specifico, che deve essere regolato per esperimenti con diversi fotosensibilizzatori e, di conseguenza, diverse curve di assorbanza.
4. Premere il touchpad (+)/(- ) per regolare la configurazione temporale (un esperimento di 60 minuti qui) e impostare la durata del test.
   NOTA: La configurazione temporale, in associazione con il valore di irraggiamento, determinerà la fluenza del processo, la dose luminosa applicata nel test.
5. Controllare le informazioni di configurazione sul display.
6. Premere il pulsante Start per avviare il test. Assicurarsi che all'inizio del test si senta un segnale acustico un cicalino.
7. Nel corso dell'esperimento, osservare le informazioni in tempo reale sul display, come l'irradianza e il tempo rimanente.
8. Non aprire lo sportello anteriore né modificare alcuna configurazione durante il test PDT.
9. Alla fine del test, attendere un cicalino a quattro bip e che il sistema elettronico spenga tutti i LED. Osservare un messaggio Finito e la quantità finale di energia spesa - fluenza - durante l'esperimento nel display.
   NOTA: il valore finale della fluenza viene calcolato utilizzando l'equazione (1):
   (1)
   Dove F è uguale a J/cm 2 e I è uguale a mW/cm 2 o mJ/s·cm ². Il valore di irraggiamento considera la potenza dei LED (sorgente emittente) e l'area uniformemente irradiata della camera oscura (660 cm 2) (equazione [2]):
   (2)
   Il valore teorico di irradianza viene visualizzato sul display del dispositivo durante l'intero test PDT. Alla fine dell'operazione, utilizzare l'equazione (3) per calcolare la fluenza:
   Fluenza (F) = irradianza (I, valore costante) × tempo di funzionamento (s) (3)

4. Saggio di vitalità cellulare

1. Dopo il test PDT, coprire la micropiastra esposta alla luce e incubare per 24 ore.
2. Dopo il periodo di incubazione, rimuovere il terreno di coltura da entrambe le piastre, lavare il monostrato di cellule con PBS (100 μL) e aggiungere la soluzione MTT (0,5 mg / ml, 100 μL). Incubare entrambe le piastre - condizioni scure e chiare - per 4 ore per consentire la formazione di cristalli formazan.
3. Rimuovere accuratamente la soluzione MTT e sciogliere i cristalli viola con una soluzione di DMSO/etanolo (1:1).
4. Dopo completa dissoluzione dei cristalli, effettuare la misura dell'assorbanza utilizzando un lettore di micropiastre a 595 nm.
   NOTA: Il dispositivo può essere utilizzato in altri importanti esperimenti come la morte cellulare ROS-mediata innescata da fotosensibilizzatori dopo esposizione alla luce mediante citometria a flusso³⁰.

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Risultati

Il dispositivo PDT finale, chiamato PhotoACT, includeva una camera oscura per allocare fino a quattro micropiastre multipozzetto, con la sua superficie interna superiore dotata di un set di 30 LED diffusi programmati per emettere spettri distinti di luce visibile (Figura 3 e File supplementare 6). Il dispositivo è stato costruito utilizzando due scatole associate: una scatola interna progettata come camera oscura per i saggi PDT e una scatola esterna per coprire la camera i...

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Discussione

Il dispositivo PhotoACT finale era comodo da costruire con componenti disponibili in commercio e a basso costo ad un costo totale inferiore a $ 50. Ulteriori vantaggi includono basse esigenze di manutenzione, la capacità di irradiare più tipi di piastre di coltura, l'uso simultaneo di un massimo di quattro unità per test, peso ridotto (2 kg)/dimensioni (44 cm³) che consente portabilità, irradiazione accurata e riproducibile (dati non mostrati) e un'interfaccia di configurazione semplice e intuitiva che non...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA (10x)	Gibco	15400054	Mammalian cell culture dissociation reagent
3D printer	Flashforge		Finder model
96-well plates			Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture
Arduino
Brightness sensor			TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface
Buttons
Buzzer
Cell culture Flasks			Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)
Centrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay
CO2 Incubator
Controller board			ESP32
Design Software	Trimble		SketchUp
DMEM High Glucose	Gibco	11965092	DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.
DMSO	Sigma-Aldrich	D4540-500ML	Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	12657029	FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15750060	Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination
Hemocytometer			Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay
Inverted Laboratory Microscope	Leica		DM IL LED
Laminar Flow Hood			Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures
LCD display
LED RGB WS2812			5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts
MDF fiberboards			3mm thickness medium-density fiberboards
Microcentrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay
Microplate reader	ThermoFischer		Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.
MTT Reagent	Invitrogen	M6494	3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays
Operational System	Real Time Engineers ltd.		FreeRTOS
P10 micripipette			Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity
P1000 micropipette			Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity
P200 micropipette			Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity
PDT Equipment	LumaCare		Model LC-122
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4	Gibco	10010031	Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures
Potentiometers
Tips			Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes
Verteporfin	Sigma-Aldrich	SML0534-5MG	Verteporfin, ≥94% (HPLC)