Ecografia ad alta risoluzione per l'analisi di tumori ATC ortotopici in un modello murino geneticamente modificato

Riepilogo

Il presente protocollo descrive l'ecografia ad alta frequenza per visualizzare l'intera ghiandola tiroidea del topo e monitorare la crescita del carcinoma anaplastico della tiroide.

Abstract

Il carcinoma anaplastico della tiroide (ATC) è associato a una prognosi sfavorevole e a un breve tempo di sopravvivenza mediano, ma nessun trattamento efficace migliora significativamente i risultati. Modelli murini geneticamente modificati che imitano la progressione dell'ATC possono aiutare i ricercatori a studiare trattamenti per questa malattia. Incrocio di tre diversi genotipi di topi, un TPO-cre/ERT2; Braf^CA/wt; È stato sviluppato il modello ATC transgenico Trp53 Δex2-10^/Δex2-10. Il modello murino ATC è stato indotto da un'iniezione intraperitoneale di tamoxifene con sovraespressione di Braf^V600E e delezione di Trp53, e i tumori sono stati generati entro circa 1 mese. L'ecografia ad alta risoluzione è stata applicata per studiare l'inizio e la progressione del tumore e la curva di crescita dinamica è stata ottenuta misurando le dimensioni del tumore. Rispetto alla risonanza magnetica (MRI) e alla tomografia computerizzata, gli ultrasuoni presentano vantaggi nell'osservazione del modello murino ATC, come essere non invasivi, portatili, in tempo reale e senza esposizione alle radiazioni. Gli ultrasuoni ad alta risoluzione sono adatti per misurazioni dinamiche e multiple. Tuttavia, l'esame ecografico della tiroide nei topi richiede conoscenze ed esperienze anatomiche rilevanti. Questo articolo fornisce una procedura dettagliata per l'utilizzo di ultrasuoni ad alta risoluzione per la scansione dei tumori nel modello ATC transgenico. Nel frattempo, vengono elencati la regolazione dei parametri ad ultrasuoni, le capacità di scansione ad ultrasuoni, l'anestesia e il recupero degli animali e altri elementi che richiedono attenzione durante il processo.

Introduzione

Sebbene il carcinoma anaplastico della tiroide (ATC) rappresenti meno del 2% dei tumori della tiroide, causa oltre il 50% dei decessi correlati al cancro della tiroide ogni anno. Il tempo mediano di sopravvivenza dopo la diagnosi con ATC è solo di circa 6 mesi e non sono disponibili trattamenti che migliorino significativamente la sopravvivenza ^1,2.

La rarità dell'ATC ha ostacolato la ricerca che studia come la malattia inizia e progredisce in modo aggressivo. Recentemente sono diventati disponibili modelli murini geneticamente modificati che imitano la malattia, che forniscono informazioni sulla malattia e sulle sue risposte ai possibili trattamenti ^3,4,5. Tali studi richiedono un'accurata imaging tumorale per le misurazioni e il monitoraggio, che viene tipicamente eseguita utilizzando la risonanza magnetica, la tomografia computerizzata o l'ecografia ad alta risoluzione ^6,7. L'ecografia è stata ampiamente utilizzata negli organi di topo. Ha vantaggi rispetto alla risonanza magnetica e alla tomografia computerizzata poiché può essere eseguita in tempo reale e non espone il soggetto a radiazioni e l'attrezzatura necessaria è abbastanza piccola da essere portatile ^8,9. Tuttavia, gli studi sul monitoraggio continuo della crescita dell'ATC mediante ultrasuoni sono rari; Pertanto, questo lavoro esplora l'utilità degli ultrasuoni in questo contesto.

Qui viene presentato un protocollo per l'utilizzo dell'ecografia ad alta risoluzione per scansionare, monitorare e misurare accuratamente i tumori in un modello murino di ATC.

Protocollo

Il presente studio è stato eseguito con l'approvazione del Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Sichuan. TPO-cre/ERT2; Braf^CA/wt; In questo studio sono stati utilizzati topi transgenici Trp53 Δex2-10^{/Δex2-10 10} (vedere Tabella dei materiali). Le fasi del protocollo possono essere modificate per diverse specie animali, se necessario. Qui sono stati utilizzati dodici topi, tra cui sei femmine e sei maschi, con un'età media di 93 giorni.

1. Preparazione sperimentale

1. Accendere il sistema ecografico (vedi Tabella dei materiali) e creare una nuova cartella per l'acquisizione delle immagini e la raccolta dei dati. Selezionare la sonda di linea a 40 MHz e fare clic sul modello di tessuto superficiale per attivare il trasduttore tissutale superficiale. Utilizzare la "modalità B" per l'imaging tiroideo (Figura 1A).
   NOTA: la modalità B è la modalità di imaging ecografico di base. L'aspetto delle immagini ecografiche si basa sulle interazioni fisiche del suono con i tessuti del corpo. Le immagini in modalità B sono prodotte come immagini grigie^11,12.
2. Tenere i topi in gabbie specifiche con libero accesso al cibo e all'acqua. Posizionare la gabbia su un dispositivo di riscaldamento supplementare (vedi Tabella dei materiali) per garantire la termoregolazione.
3. Garantire una quantità sufficiente di isoflurano nel vaporizzatore e O₂ nel serbatoio. Se le forniture sono inadeguate, scambiare i serbatoi con quelli nuovi.
4. Pulire la piattaforma di imaging animale con soluzione salina sterile e accendere il pulsante di riscaldamento. Verificare che la temperatura sia di 38-40 °C prima di posizionare l'animale sulla piattaforma (Figura 1C).

2. Preparazione animale per l'imaging

1. Accendere il vaporizzatore isoflurano. Trasferire il mouse dalla gabbia alla scatola dell'anestetico.
2. Anestetizzare l'animale usando una miscela di 1%-2% di isoflurano dal vaporizzatore e ossigeno che scorre a 0,8 L/min.
3. Applicare la crema depilatoria dal petto al collo, attendere 30 secondi, quindi asciugare completamente la crema e la pelliccia. Risciacquare accuratamente l'area e la pelliccia circostante con soluzione salina calda e sterile.
4. Posizionare l'animale anestetizzato sulla piattaforma riscaldata. Coprire il muso con un cono nasale collegato all'uscita dell'anestesia (Figura 2A, B).
   NOTA: Il mouse deve essere completamente sedato entro 1-2 minuti. Se l'animale è ancora attivo, eseguire un'induzione prolungata dell'isoflurano fino a quando l'animale non mostra più un riflesso di ritiro del pedale. Assicurati che l'animale respiri stabilmente.
5. Durante l'imaging, monitorare la frequenza cardiaca del mouse attraverso la piattaforma riscaldata.
   NOTA: Il sistema di imaging ecografico è dotato di un cardiofrequenzimetro.
6. Usa del nastro adesivo per fissare gli arti del topo alla piattaforma riscaldata, con l'animale in posizione supina. Assicurarsi che il cono del naso sia posizionato stabilmente con un flusso costante di gas anestetico (1,5 L/min).
7. Proteggi gli occhi applicando un unguento oftalmico.

3. Imaging tumorale

1. Regolare il sistema di imaging per ottimizzare la risoluzione. Impostare i seguenti parametri: guadagno bidimensionale, 25-30 dB; profondità immagine, 10 mm; numero di zone focali, 3; e centro, 3-6 mm.
   NOTA: Per il presente studio è stata utilizzata una sonda a 40 MHz. La modalità B è stata specificata per l'acquisizione dei dati.
2. Applicare liberamente il gel ad ultrasuoni (vedi Tabella dei materiali) sull'area della pelle nuda.
3. Tenere la sonda e metterla a contatto con il gel ad ultrasuoni sul torace, quindi eseguire la scansione dal torace verso il collo per individuare la tiroide (Figura 2C).
   NOTA: Applicare delicatamente la pressione durante la scansione; Un'eccessiva pressione sul collo dell'animale può causare ansimare o apnea. Questo protocollo è stato sviluppato sulla base della scansione portatile, ma la scansione meccanizzata può anche essere eseguita utilizzando una macchina per guidare la sonda, come una piattaforma di imaging animale che si muove lungo gli assi x e y.
4. Scansione su e giù per identificare i confini del tumore e valutarne le dimensioni e la forma.
   NOTA: Una tiroide sana di solito appare come una struttura ipoecogena e omogenea davanti alla trachea. I tumori anaplastici fanno apparire la tiroide molto più grande, che può essere facilmente identificata dalla scansione del collo (Figura 3).
5. Identificare i tumori ATC dalla trachea e dai muscoli della cinghia a seconda della posizione anatomica e dell'ecografia ecografica.
   NOTA: I muscoli della cinghia si trovano davanti alla tiroide e alla trachea, così come dietro la tiroide. L'eco ecografica dei muscoli della cinghia appare superiore a quella dell'ATC, mentre l'attenuazione esiste dietro la trachea¹³.
   1. Sulla base dell'impressione del tumore totale, confermare la sezione dell'immagine con il più grande diametro tumorale da sinistra a destra. Premere il pulsante di congelamento e misurare i diametri tumorali anteroposteriore e da sinistra a destra utilizzando il calibro ad ultrasuoni.
      NOTA: Il diametro anteroposteriore deve essere misurato perpendicolarmente al diametro del tumore da sinistra a destra (Figura 4). La dimensione del tumore dell'ATC è stata calcolata moltiplicando il diametro anteroposteriore per il diametro del tumore da sinistra a destra¹⁴. Poiché la dimensione dei tumori sui lati sinistro e destro era incoerente, ciascun lato dei tumori è stato calcolato separatamente. La dimensione totale dei tumori è stata ottenuta aggiungendo i tumori bilaterali. Le dimensioni sono state registrate per osservare la curva di crescita dell'ATC.
6. Salva la registrazione come cine loop, che facilita la revisione delle immagini selezionate.

4. Recupero degli animali

1. Dopo la scansione, pulire il gel ad ultrasuoni e rimuovere il nastro di contenimento dagli arti dell'animale.
2. Posizionare il mouse sul dispositivo di riscaldamento supplementare (punto 1.2). Appoggiare l'animale su un fianco (Figura 2D).
3. Dopo che il mouse si è ripreso (~ 5 minuti), trasferirlo di nuovo nella gabbia.
4. Pulire il sistema ecografico, la sonda e la piattaforma utilizzando un panno morbido e salviette con alcool isopropilico o glutaraldeide.
5. Spegnere il sistema di imaging.

Risultati

La dimensione media dell'ATC destro all'inizio dello studio era di 4,867 mm 2 e la dimensione media dell'ATC sinistro era di 5,189 mm². Nella quarta misurazione, la dimensione media dell'ATC destro era cresciuta a 11,844 mm 2, mentre la dimensione del tumore del lobo sinistro era cresciuta fino a 9,280 mm². La dimensione totale dell'ATC è aumentata da 10.057 mm 2 a 15.843 mm². Nella fase successiva dello studio, l'ATC è cresciuto rapidamente. In termini ...

Discussione

Questo protocollo utilizza l'ecografia ad alta risoluzione per analizzare i tumori ATC ortotopici in un modello murino geneticamente modificato. Il modello transgenico, con genotipo TPO-cre/ERT2; Braf^CA/wt; Trp53 Δex2-10^/Δex2-10, è stato sviluppato nel nostro laboratorio. Gli animali sovraesprimono Braf^V600E e mancano di Trp53; L'iniezione intraperitoneale di tamoxifene porta alla crescita del tumore dopo circa 1 mese¹⁰. I tumori crescono rapid...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive tape	Winner
Anesthesia system	RWDlifescience
Brafflox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Chamber for anesthesia induction	RWDlifescience
Cotton swabs	Winner
Depilatory cream	Veet
Electric heating blanket	Petbee
Isoflurane vaporizer	RWDlifescience
Medical gloves	Winner
Paper towels	Breeze	B914JY
TPO-cre/ERT2 mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Trp53flox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Ultrasound gel	Keppler	KL-250
Ultrasound machine	VisualSonics	Vevo 3100