Trasferimento adottivo di macrofagi stimolati da IL-33 in modelli murini indotti da bleomicina per studiare il loro effetto sulla fibrosi polmonare idiopatica in vivo

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'isolamento dei macrofagi interstiziali polmonari (IM) e il loro trasferimento adottivo dopo stimolazione IL-33 degli alveoli polmonari in un modello murino, che può facilitare lo studio in vivo della fibrosi polmonare idiopatica (IPF).

Abstract

La risposta infiammatoria causata da lesioni polmonari precoci è una delle cause importanti dello sviluppo della fibrosi polmonare idiopatica (IPF), che è accompagnata dall'attivazione di cellule infiammatorie come macrofagi e neutrofili, nonché dal rilascio di fattori infiammatori tra cui TNF-α, IL-1β e IL-6. È noto che l'infiammazione precoce causata dall'attivazione dei macrofagi interstiziali polmonari (IM) in risposta alla stimolazione di IL-33 svolge un ruolo vitale nel processo patologico dell'IPF. Questo protocollo descrive il trasferimento adottivo di IMs stimolati da IL-33 nei polmoni dei topi per studiare lo sviluppo dell'IPF. Coinvolge l'isolamento e la coltura di IM primari dai polmoni del topo ospite, seguito dal trasferimento adottivo di IM stimolati negli alveoli di topi riceventi IPF indotti da bleomicina (BLM) (che sono stati precedentemente impoveriti di macrofagi alveolari dal trattamento con liposomi clodronati) e la valutazione patologica di quei topi. I risultati rappresentativi mostrano che il trasferimento adottivo di macrofagi stimolati da IL-33 aggrava la fibrosi polmonare nei topi, suggerendo che l'istituzione dell'esperimento di trasferimento adottivo dei macrofagi è un buon mezzo tecnico per studiare la patologia dell'IPF.

Introduzione

La fibrosi polmonare idiopatica (IPF) è una malattia infiammatoria polmonare diffusa causata da molti fattori¹. Nel microambiente delle citochine della risposta immunitaria Th1 e Th2, i macrofagi possono essere polarizzati in macrofagi classicamente attivati (M1) e alternativamente attivati macrofagi (M2). I lipopolisaccaridi (LPS) o la citochina IFN- γ inducono i macrofagi M1 a polarizzarsi e produrre citochine pro-infiammatorie, tra cui iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α e IL-12. Al contrario, le citochine di tipo II IL-4 e IL-13 guidano la polarizzazione dei macrofagi M2, che possono produrre diversi fattori promotori della crescita dei fibroblasti, come TGF-β e PDGF, che promuovono la fibrosi polmonare². Il processo patologico dell'IPF è accompagnato dall'attivazione e dall'infiltrazione dei macrofagi. L'IPF media la riparazione delle lesioni, l'infiammazione e la fibrosi attraverso il rilascio di citochine³. Poiché sono disponibili solo opzioni terapeutiche limitate, l'esplorazione dei meccanismi patologici molecolari dell'IPF ha un grande significato per lo sviluppo di nuove strategie per la prevenzione e il trattamento dell'IPF. Precedenti studi del nostro gruppo e di altri ricercatori ^4,5 hanno confermato l'aumento del rilascio di IL-33 nei pazienti con IPF e in modelli murini con IPF indotta da bleomicina (BLM). IL-33 viene rilasciato dalle cellule epiteliali ed endoteliali durante la fibrosi ed è coinvolto nell'attivazione dei macrofagi, con conseguente proliferazione anormale dei fibroblasti, infiltrazione leucocitaria e l'eventuale perdita della funzione polmonare⁵. L'attuale protocollo descrive il trasferimento adottivo di macrofagi interstiziali stimolati da IL-33 (IM) negli alveoli come mezzo per studiare lo sviluppo dell'IPF in modelli murini. Qui, gli IM sono stati isolati dal tessuto polmonare dei topi ospiti, coltivati in vitro, stimolati con IL-33 per 24 ore e quindi trasferiti adottivamente negli alveoli dei topi riceventi mediante iniezione tracheale. La raccolta diretta di macrofagi di topo stimolati e il loro trasferimento adottivo negli alveoli riceventi è risultato aggravare il grado di fibrosi polmonare e può illustrare più chiaramente l'influenza dei fattori stimolanti sulla fibrosi rispetto agli studi precedenti⁶. La tecnica descritta in questo articolo può consentire ai ricercatori di esplorare la funzione dei macrofagi stimolati da potenziali citochine nello sviluppo dell'IPF.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico sperimentale per il benessere degli animali dell'Università di Jiangnan (JN n. 20211¹³⁰m1720615[501]).

NOTA: In totale, in questo studio sono stati utilizzati 10 topi maschi C57BL / 6 di età compresa tra 6-8 settimane e del peso di 20-25 g. I tre gruppi sperimentali nello studio includevano tre topi riceventi ciascuno e un topo ospite è stato utilizzato per l'isolamento IM.

1. Esaurimento dei macrofagi polmonari di topo

1. Estrarre il flaconcino di liposomi clodronati (vedere Tabella dei materiali) dal frigorifero con 30 minuti di anticipo, riscaldarlo a temperatura ambiente e capovolgerlo più volte per garantire una miscelazione uniforme.
   NOTA: I liposomi clodronati incapsulano le molecole idrofile diclorometilene bifosfonato. Quando questi liposomi vengono consumati dai macrofagi, il clodronato viene gradualmente rilasciato dall'azione della fosfatasi lisosoma e il suo accumulo innesca di conseguenza l'apoptosi cellulare e l'esaurimento dei macrofagi⁷.
2. Anestetizzare i topi con isoflurano al 3%. Controlla la profondità dell'anestesia pizzicando un piede per verificare la coscienza. Applicare un unguento veterinario su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza in anestesia.
3. Aspirare 60 μL di liposomi clodronati utilizzando una pipetta con una punta di aspirazione sterile. Somministrare il farmaco goccia a goccia nella cavità nasale del topo anestetizzato, in modo tale che quando il topo inala, il farmaco viene inalato nella trachea. Dopo ogni goccia, assicurarsi che il topo inali completamente il farmaco e respiri in modo uniforme. Somministrare liposomi contenenti solo PBS come controllo⁸ (Figura 2).
4. Posizionare i topi su una tabella a temperatura costante di 38 ° C per il riscaldamento per accelerare il loro recupero. Monitora i topi fino al loro risveglio. Dopo che i topi si sono ripresi bene e hanno raggiunto la recumbentenza sternale, trasferirli nella gabbia.
5. Utilizzare topi con macrofagi alveolari impoveriti 2 giorni dopo il trattamento con liposomi clodronati come topi riceventi per l'esperimento di trasferimento.
   NOTA: In questo studio, la deplezione dei macrofagi alveolari è stata confermata controllando l'espressione dei marcatori macrofagici come descritto in precedenza ^8,9 dopo la somministrazione di liposomi clodronati per inalazione (vedere Figura supplementare 1).

2. Isolamento e cultura dei GI

1. Anestetizzare il topo ospite con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (120 mg/kg) e xilazina (16 mg/kg). Confermare la profondità dell'anestesia attraverso la perdita del riflesso del pizzicamento della punta. Applicare un unguento veterinario su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza in anestesia. Quindi, disinfettare la pelle del topo anestetizzato con alcol al 75% e iodio. Usa le forbici per tagliare la pelle ed esporre il tessuto cardiopolmonare
2. Aspirare 10 mL di 1x PBS in una siringa con un ago da 20 G e inserire la punta dell'ago nell'atrio destro del mouse (Figura 3A). Tagliare la vena cava inferiore del topo con le forbici chirurgiche, quindi perfondere manualmente il topo con PBS a velocità costante (10-20 ml / min) fino a quando il tessuto polmonare diventa bianco. Asportare il tessuto polmonare e trasferirlo in PBS ghiacciato in un piatto di coltura (Figura 3B).
3. Tagliare il tessuto polmonare in frammenti di circa 2 mm x 2 mm x 2 mm. Quindi, aggiungere 15 ml di terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente l'1% di collagenasi A al tessuto polmonare per isolare i macrofagi. Incubare a 100 giri/min per 30 minuti su tavola vibrante a 37 °C.
4. Aspirare la sospensione del tessuto polmonare attraverso una siringa da 10 ml almeno 20 volte per renderla il più fine possibile. Filtrare questa sospensione attraverso un filtro cellulare da 40 μm. Centrifugare il filtrato a 400 x g per 10 minuti ed eliminare il surnatante.
5. Lisare i globuli rossi nel pellet aggiungendo 3 ml di tampone di lisi RBC (vedi Tabella dei materiali) sul ghiaccio per 2-3 minuti.
6. Dopo centrifugazione a 150 x g per 5 minuti, risospendere il pellet cellulare con 10 mL di DMEM (contenente 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina). Contare le cellule usando un emocitometro.
7. Seminare le cellule in piastre di coltura cellulare aderente di 10 cm a 2 x 10⁷ cellule/piatto e incubare per 1 ora a 37 °C e 5% di CO₂. Ciò consente agli IM polmonari di aderire al piatto⁵. Dopo 1 ora, aspirare il surnatante e le cellule galleggianti e aggiungere 10 ml di terreno di coltura fresco completo (DMEM contenente 10% FBS, 100 U / mL di penicillina e 100 μg / mL di streptomicina). Incubare per più di 8 ore o durante la notte.
8. Determinare la purezza degli IM ottenuti utilizzando citometria a flusso con colorazione per i marcatori F4/80 e CD11c, come descritto in precedenza⁵ (vedere Figura supplementare 1).

3. Trasferimento adottivo di IMs negli alveoli polmonari

1. Sostituire il terreno di coltura della piastra contenente gli IM polmonari isolati (fase 2.7) con un terreno di coltura completo contenente 10 ng/mL IL-33 per stimolare gli IM. Incubare per 24 ore a 37 °C e 5% CO₂. Utilizzare 1x PBS al posto di IL-33 come controllo.
2. Dissociare gli IM polmonari trattandoli con 1 mL di tripsina allo 0,25% per 5 minuti. Quindi, estinguere la digestione aggiungendo 3 ml di terreno completo di coltura fresca e raccogliere i macrofagi polmonari centrifugando la sospensione cellulare a 150 x g e 4 ° C per 5 minuti. Contare le cellule usando un emocitometro e risospendere le cellule in PBS ad una concentrazione finale di 5 x 10⁵ cellule / 50 μL.
3. Anestetizzare i topi riceventi con il 3% di gas isoflurano. Attendere che il topo diventi incosciente (come nel punto 1.2), quindi fissare gli arti del topo anestetizzato su una piastra verticale con nastro medico. Tirare delicatamente la lingua del topo da un lato usando un batuffolo di cotone.
4. Accendi la lampada di intubazione e illuminala sulla gola del topo in modo che la trachea possa essere vista. Controllare che la trachea sia vicina alla base della lingua, l'esofago è vicino alla parte posteriore del collo, ma l'apertura dell'esofago non è visibile durante l'operazione.
5. Utilizzare la lampada di intubazione (22 G) per aiutare a intubare il mouse. Guidare la cannula dell'ago a permanenza nella trachea con un filo guida (diametro 0,4 mm). Rimuovere il filo guida e spingere la cannula nella trachea del topo per completare l'intubazione.
6. Dopo aver osservato che la cannula entra nella trachea, iniettare 50 μL della sospensione cellulare (contenente 5 x 10⁵ IM) nel topo ricevente attraverso la trachea.
7. Posizionare i topi su un pad riscaldante costante a 38 ° C per il riscaldamento per accelerare il recupero. Monitora i topi fino al loro risveglio. Dopo che si sono ripresi bene e hanno raggiunto la recumbentcy sternale, trasferirli nella gabbia.
8. Dopo 24 ore, somministrare bleomicina (BLM) attraverso la trachea (utilizzando la procedura nei punti 3.3-3.5) alla dose di 1,4 U/kg di peso corporeo per indurre l'IPF. Somministrare un volume uguale di soluzione salina al gruppo di controllo.
9. Dopo 21 giorni, determinare il grado di gravità della fibrosi polmonare per i diversi gruppi di topi che sono stati trasferiti adottivamente con PBS o sospensione IM stimolata da IL-33 valutando l'espressione dei marcatori per la fibrosi e i punteggi di Ashcroft¹⁰.
   1. Estrarre l'RNA totale dal tessuto polmonare utilizzando un reagente di estrazione dell'RNA (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: L'analisi quantitativa è stata effettuata con un lettore di micropiastre. Se il rapporto OD260/OD280 è 1,8-2,0, la purezza dell'RNA è elevata. Tutti i campioni sono stati conservati a -80 ° C.
   2. Eseguire la PCR quantitativa a fluorescenza per valutare l'espressione di actina α-liscia (SMA) e fibronectina utilizzando primer specifici.
      NOTA: I primer utilizzati per α-SMA erano avanti 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' e inverso 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3', e i primer utilizzati per la fibronectina erano avanti 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' e inverso 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTTGT-3'.
10. Eseguire l'immunoistochimica come descritto di seguito.
    1. Disidratare il polmone sinistro, incorporarlo e affettarlo con un'affettatrice di paraffina per uno spessore di 4 μm.
    2. Posizionare le sezioni di tessuto sui vetrini e cuocere i vetrini in forno a 65-70 ° C per 30 minuti a 1 ora. Decerare i vetrini con una percentuale decrescente di alcol (cioè 100%, 95%, 90%, 80% e 70% di alcol) per 5 minuti.
    3. Colorare i vetrini in soluzione di colorante di ematossilina (analiticamente pura) per 5 minuti. Quindi, lavare gli scivoli con acqua di rubinetto. Immergere gli scivoli in alcool cloridrico all'1% per 3 secondi, lavare via il colore galleggiante e immergere in acqua corrente per 5 minuti. Le sezioni diventeranno blu.
    4. Immergere nella soluzione di eosina per 10 s a 1 min (determinare il tempo di tintura in base al colore), lavare con acqua di rubinetto e mettere in alcool al 70%, 80%, 95%, 100% e 100%, rispettivamente, per 5 minuti ciascuno. Quindi posizionare, i vetrini in soluzioni di xilene I e xilene II per 3 min. Dopo l'asciugatura, osservare e scattare foto al microscopio verticale con pellicola sigillante adesiva neutra.
    5. Eseguire il punteggio Ashcroft sulle sezioni per indicare la gravità della fibrosi polmonare¹⁰. Eseguire analisi statistiche dei dati utilizzando un t-test di due campioni indipendenti.

Risultati

Il protocollo utilizzato qui è riepilogato nel diagramma di flusso nella Figura 1. L'inalazione di liposomi clodronati attraverso il naso (Figura 2) è stata utilizzata per esaurire i macrofagi polmonari dei topi adulti C57BL / 6, e questo ha prodotto un buon modello murino ricevente. Gli IM polmonari sono stati isolati da un altro topo non trattato (ospite) (Figura 3A,B) e coltivati in vitro. I macrofagi...

Discussione

Questo studio fornisce un metodo efficace per esaurire, isolare, coltivare e trasferire i macrofagi, che può aiutare a studiare i meccanismi della fibrosi polmonare nei topi. Esistono molti metodi per l'esaurimento dei macrofagi di topo, come la somministrazione tracheale, l'iniezione della vena caudale e l'inalazione nasale¹¹. Questo studio ha ottimizzato il metodo di inalazione nasale, che è semplice da utilizzare e può effettivamente esaurire i macrofagi polmonari

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life technologies Biotechnology,USA	1508012
Arterial indwelling needle	B Braun Melsingen AG,Germany	21G15G8393
BD Accuri C6 Plus	Becton Dickinson,USA
Bleomycin	Biotang, USA	Ab9465
Carbon dioxide incubator	Thermo Forma, USA	Thermo Forma370
CD11b	R&D Systems,USA	1124F
CD11c	R&D Systems,USA	N418
Cell culture dish	Thermo Forma, USA	174926
Clodronate liposomes	Clodronate liposomes,Netherlands	CI-150-150
Collagenase A	Sigma-Aldrich, USA	10103578001
F4/80	R&D Systems,USA	521204
Falcon Cell Strainer	Becton,Dickinson and Company, USA	352340
Fetal bovine serum (FBS)	Life technologies,USA	1047571
Hematoxylin Eosin	Nanjing Jiancheng Technology,China	06-570
LightCycler 480 PCR detection system	Roche, USA
Murine recombinant factor IL-33	Peprotech, USA	210-33
Nikon microscope	Nikon Corporation, Japan	941185
Penicillin, streptomycin	Life technologies,USA	877113
Phosphate buffer (PBS)	Guangdong Huankai Microbial Technology ,China	1535882
RBC lysis buffer	Beyotime Biotechnology Company,China	C3702
RNA Isolater	Vazyme company,China	R401-01-AA	Total RNA extraction reagent
RWD Inhalation Anesthesia Machine	Shenzhen Rayward Life Technology ,China	R500
Semi-automatic paraffin slicer	Leica, Germany	LeicaRM2245
SYBR Premix Ex Taq	Takara, Japan	410800
Trypsin 0.25%	Life Technologies, USA	1627172