Imaging micro-CT e analisi morfometrica del cervello neonatale del topo

Riepilogo

Questo studio descrive i passaggi per ottenere immagini ad alta risoluzione del cervello di topo neonatale combinando la micro-tomografia computerizzata (micro-CT) e un agente di contrasto in campioni ex vivo . Descriviamo le analisi morfometriche di base per quantificare le dimensioni e la forma del cervello in queste immagini.

Abstract

Le neuroimmagini sono uno strumento prezioso per studiare la morfologia del cervello in esperimenti che utilizzano modelli animali. La risonanza magnetica per immagini (MRI) è diventata il metodo standard per i tessuti molli, anche se la sua bassa risoluzione spaziale pone alcuni limiti per i piccoli animali. In questo articolo, descriviamo un protocollo per ottenere informazioni tridimensionali (3D) ad alta risoluzione su cervelli e crani di topi neonati utilizzando la micro-tomografia computerizzata (micro-CT). Il protocollo include quei passaggi necessari per sezionare i campioni, colorare e scansionare il cervello e ottenere misurazioni morfometriche dell'intero organo e delle regioni di interesse (ROI). L'analisi delle immagini include la segmentazione delle strutture e la digitalizzazione delle coordinate dei punti. In sintesi, questo lavoro dimostra che la combinazione di micro-CT e soluzione di Lugol come agente di contrasto è un'alternativa adatta per l'imaging del cervello perinatale di piccoli animali. Questo flusso di lavoro di imaging ha applicazioni nella biologia dello sviluppo, nella biomedicina e in altre scienze interessate a valutare l'effetto di diversi fattori genetici e ambientali sullo sviluppo del cervello.

Introduzione

L'imaging con tomografia microcomputerizzata (micro-CT) è uno strumento prezioso per diversi campi di ricerca. In biologia, è particolarmente adatto per la ricerca sulle ossa a causa dell'assorbimento dei raggi X nei tessuti mineralizzati. A causa di questa caratteristica, diverse questioni riguardanti lo sviluppo osseo¹, il metabolismo² e l'evoluzione ^3,4, tra gli altri argomenti, sono state affrontate con l'assistenza della micro-TC. Nel 2008, de Crespigny et ^al.5 hanno dimostrato che le immagini micro-CT di cervell....

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali hanno seguito le linee guida del Canadian Council on Animal Care.

1. Raccolta e preparazione dei campioni

1. Preparare 500 ml di paraformaldeide (PFA) al 4%.
   1. Sotto un flusso di estrazione in un armadio, aggiungere 20 g di polvere di PFA a 250 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in un becher di vetro da 1 L. Posizionare il becher con un magnete su una piastra magnetica per mescolare.
   2. Mescolare mentre si riscalda. Con un termometro, controllare costantemente la temperatura della soluzione per mantenerla al di sotto dei 60 °C.
   3. Con una pipetta Pa....

Discussione

In questo lavoro, viene introdotto un protocollo conciso per la scansione dei tessuti cerebrali neonatali di topi utilizzando la micro-TC con un agente di contrasto. Inoltre, include procedure semplici per ottenere risultati quantitativi e qualitativi. Sulla base di questi metodi, è possibile eseguire ulteriori analisi alternative o complementari.

Come mostrato nel protocollo, le immagini micro-CT possono essere analizzate in diversi modi. In studi precedenti, il nostro gruppo ha stimato la v.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
µCT 35	Scanco Medical AG		Note that Scanco does not offer the  µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the  µCT 45
Avizo	Visualization Sciences Group, VSG
C57BL/6 Mice	Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata
Conical tubes	Daigger	CH-CI4610-1856
Flux cabinet	Esco	AC2-458
Glass beaker	Glassco	GL-229.202.10
Glass bottle	Simax	CFB017
Glass funnel	HDA	VI1108
HCl	Carlo Erba	403872	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
I2	Cicarelli	804211	When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
KI	Cicarelli	PA131542.1210	When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Magnetic stirring	Arcano	4925
NaOH	Cicarelli	1580110	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Orbital shaker	Biomint	BM021
Paraformaldehyde	Biopack	2000959400	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Paton spatula	Glassco	GL-377.303.01
PBS	Biopack	2000988800
Plastic Pasteur pipette	Daigger	9153
R	R Project		The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html)
Scissors	Belmed
Sodium azide	Biopack	2000163500
Thermometer	Daigger	7650