Analisi di goccioline lipidiche colorate con fluorescenza con ricostruzione 3D per la valutazione della steatosi epatica

Riepilogo

Qui, dimostriamo un protocollo ottimizzato basato sulla fluorescenza BODIPY 493/503 per la caratterizzazione delle goccioline lipidiche nel tessuto epatico. Attraverso l'uso di proiezioni ortogonali e ricostruzioni 3D, il fluoroforo consente una discriminazione di successo tra steatosi microvescicolare e macrovescicolare e può rappresentare un approccio complementare ai protocolli istologici classici per la valutazione della steatosi epatica.

Abstract

Le goccioline lipidiche (LD) sono organelli specializzati che mediano l'accumulo lipidico e svolgono un ruolo molto importante nel sopprimere la lipotossicità e prevenire le disfunzioni causate dagli acidi grassi liberi (FA). Il fegato, dato il suo ruolo critico nel metabolismo dei grassi del corpo, è costantemente minacciato dall'accumulo intracellulare di LD sotto forma di steatosi epatica sia microvescicolare che macrovescicolare. La caratterizzazione istologica delle LD si basa tipicamente su coloranti diazo liposolubili, come la colorazione Oil Red O (ORO), ma una serie di svantaggi ostacola costantemente l'uso di questa analisi con campioni di fegato. Più recentemente, i fluorofori lipofili 493/503 sono diventati popolari per visualizzare e localizzare le LD a causa del loro rapido assorbimento e accumulo nel nucleo delle goccioline lipidiche neutre. Anche se la maggior parte delle applicazioni sono ben descritte in colture cellulari, ci sono meno prove che dimostrano l'uso affidabile di sonde fluorofore lipofile come strumento di imaging LD in campioni di tessuto. Qui, proponiamo un protocollo ottimizzato basato su dipirrometene di boro (BODIPY) 493/503 per la valutazione delle LD in campioni di fegato da un modello animale di steatosi epatica indotta da dieta ricca di grassi (HFD). Questo protocollo copre la preparazione del campione di fegato, il sezionamento dei tessuti, la colorazione BODIPY 493/503, l'acquisizione delle immagini e l'analisi dei dati. Dimostriamo un aumento del numero, dell'intensità, del rapporto di area e del diametro delle LD epatiche durante l'alimentazione HFD. Utilizzando proiezioni ortogonali e ricostruzioni 3D, è stato possibile osservare l'intero contenuto di lipidi neutri nel nucleo LD, che apparivano come goccioline quasi sferiche. Inoltre, con il fluoroforo BODIPY 493/503, siamo stati in grado di distinguere microvescicole (1 μm < d ≤ 3 μm), vescicole intermedie (3 μm < d ≤ 9 μm) e macrovescicole (d > 9 μm), consentendo la corretta discriminazione della steatosi microvescicolare e macrovescicolare. Nel complesso, questo protocollo basato sulla fluorescenza BODIPY 493/503 è uno strumento affidabile e semplice per la caratterizzazione epatica della LD e può rappresentare un approccio complementare ai protocolli istologici classici.

Introduzione

Le goccioline lipidiche (LD), classicamente viste come depositi di energia, sono organelli cellulari specializzati che mediano l'accumulo di lipidi e comprendono un nucleo lipidico neutro idrofobico, che contiene principalmente esteri di colesterolo e trigliceridi (TG), incapsulati da un monostrato fosfolipidico ^1,2,3.

La biogenesi LD avviene nel reticolo endoplasmatico (ER), iniziando con la sintesi di triacilglicerolo (TAG) ed esteri sterolici. I lipidi neutri sono diffusi tra i lembi del doppio strato ER a basse concentrazioni, ma si fondono in ....

Protocollo

Tutte le procedure animali eseguite in questo studio sono state approvate dall'Istituto di Coimbra per la ricerca clinica e biomedica (iCBR) Animal Welfare Body (ORBEA, # 9/2018) e conformi alle direttive nazionali ed europee sulla cura degli animali e alle linee guida ARRIVE.

1. Progettazione sperimentale

1. Coppia di ratti Wistar maschi di 13 settimane in gabbie ventilate in condizioni ambientali controllate di temperatura (22 °C ± 1 °C), umidità (50%-60%) e luce (ciclo luce-buio 12 ore) e con accesso ad libitum all'acqua del rubinetto e al chow standard per roditori.
2. Dopo un periodo di acclimata....

Discussione

Questo protocollo basato sulla fluorescenza BODIPY 493/503 per la valutazione della LD mirava a sviluppare un nuovo approccio di imaging per la valutazione della steatosi epatica. Data la forte correlazione tra obesità e steatosi epatica, la dieta ricca di grassi in stile occidentale è stata utilizzata per stabilire un modello animale di steatosi epatica²⁶. Un robusto aumento del contenuto di TG epatici è stato confermato da un kit di test colorimetrici quantitativi dei trigliceridi, che ha sug.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set	Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR	D1306
70% ethanol	Honeywell	10191455
Adobe Illustrator CC	Adobe Inc.	Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717	Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany	8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)	Daido Sangyo Co., Ltd, Japon	_
Blade	Leica	221052145	Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5	https://cellprofiler.org/releases/	Used to analyse the acquired images
Coverslips	Menzel-Glaser, Germany	_
Cryomolds	Tissue-Tek	_
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S	Leica Biosystems	_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D-8418	Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler)	Novolab	A26742
Dumont forceps	Fine Science Tools, Germany	11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm)	Thermo Scientific	150318	Used to weigh the liver after dissection
Glycergel	DAKO Omnis	S303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1	GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat diet	Envigo, Barcelona, Spain	MD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL)	Dechra	791/01/14DFVPT	Used at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; )	Carl Zeiss, germany	LSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)	Dechra	1838 ESP / 020/01/07RFVPT	Used at a final concentration of 1 mg/kg
Needle	BD microlance	300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade	Swann-Morton	205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)	Carl Zeiss, Germany
Paint brushes	Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X	Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3)	Gilson	1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	P3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3	Swann-Morton	0208
Slide staining system StainTray	Simport Scientific	M920
Standard diet	Mucedola	4RF21
Superfrost Plus microscope slides	Menzel-Glaser, Germany	J1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting media	VWR CHEMICALS	361603E
Triglycerides colorimetric assay kit	Cayman Chemical	10010303
Ultrasonic bath	Bandelin Sonorex	TK 52
Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge	Fine Science Tools, Germany	15000-00
ZEN Black software	Zeiss