Metodo di allevamento manuale per i cuccioli di uistitì

Riepilogo

Qui descriviamo un metodo di allevamento manuale per allevare i cuccioli di uistitì in un'incubatrice per animali. Questo metodo aumenta notevolmente il tasso di sopravvivenza dei neonati di uistitì, il che offre l'opportunità di studiare lo sviluppo di neonati di uistitì con background genetici simili cresciuti in diversi ambienti postnatali.

Abstract

L'uistitì comune (Callithrix jacchus) è una scimmia del Nuovo Mondo piccola e altamente sociale con alti tassi di riproduzione, che ha dimostrato di essere un modello convincente di primate non umano per la ricerca biomedica e neuroscientifica. Alcune femmine partoriscono tre gemelli; Tuttavia, i genitori non possono allevarli tutti. Per salvare questi neonati, abbiamo sviluppato un metodo di allevamento manuale per allevare gli uistitì appena nati. In questo protocollo, descriviamo la formula del cibo, il tempo per l'alimentazione, la configurazione della temperatura e dell'umidità, nonché l'adattamento dei neonati allevati a mano all'ambiente della colonia. Questo metodo di allevamento manuale aumenta significativamente il tasso di sopravvivenza dei neonati di uistitì (senza allevamento manuale: 45%; con allevamento manuale: 86%) e offre l'opportunità di studiare lo sviluppo di neonati di uistitì con background genetici simili cresciuti in diversi ambienti postnatali. Poiché il metodo è pratico e facile da usare, prevediamo che potrebbe essere applicato anche ad altri laboratori che lavorano con gli uistitì comuni.

Introduzione

L'uistitì comune (Callithrix jacchus) è una piccola scimmia arboricola del Nuovo Mondo originaria dell'America meridionale e centrale. L'uso degli uistitì nella ricerca biomedica è cresciuto rapidamente negli ultimi decenni a causa di diversi vantaggi chiave degli uistitì rispetto ad altri primati non umani (NHP), tra cui le loro dimensioni corporee più piccole, la più facile manipolazione e riproduzione in cattività, il tempo di gestazione più breve, la maturazione sessuale precoce e i minori rischi zoonotici 1,2,3,4,5,6 . L'uistitì comune ha una struttura cerebrale e una funzione cerebrale simili a quelle degli esseri umani e mostra un ricco repertorio di vocalizzazioni e comportamenti altamente sociali con ricche emozioni. Si tratta di un modello NHP convincente per diversi tipi di studi neuroscientifici, come gli studi sull'elaborazione sensoriale 7,8,9,10,11,12,13,14, la comunicazione vocale 15,16,17,18,19^, i modelli di lesione del midollo spinale ²⁰,^21,22,23, morbo di Parkinson 24,25,26,27,28 e malattie legate all'età ²⁹. Rispetto ad altri NHP, l'uistitì comune ha un tasso di riproduzione relativamente elevato, che è potenzialmente utile per la modificazione transgenica^30,31,32. Questo primate è anche ampiamente utilizzato in farmacologia, angiografia e studi patogeni e immunitari 33,34,35,36,37,38,39. Tuttavia, l'offerta di uistitì rimane molto limitata, soprattutto in Cina, e non riesce a soddisfare le esigenze in rapida crescita della ricerca scientifica.

Nelle colonie di uistitì, gli animali adulti vengono nutriti una o due volte al giorno, e alcune istituzioni modificano la dieta per i giovani uistitì⁴⁰. Generalmente, i cuccioli di uistitì di solito si aggrappano saldamente al corpo del padre o dei fratelli maggiori per le cure quotidiane e vengono consegnati alla madre più volte al giorno per il latte. Alcune femmine di uistitì partoriscono tre gemelli e, in questo caso, uno o due piccoli non possono sopravvivere a causa della mancanza di latte; Inoltre, alcuni genitori non si prendono cura dei loro bambini perché non hanno esperienza di allattamento o per altri motivi sconosciuti. Questa è una grande perdita per molti laboratori. Alcuni studi hanno riportato metodi di gestione della nutrizione per uistitì adulti in ambienti in cattività 40,41,42 utilizzando alimenti e formule con diverse composizioni di macronutrienti, vitamine e minerali, nonché diversi protocolli di alimentazione per l'arricchimento (schiacciato, gelificato, purificato o in scatola)^2,41. Uno studio precedente ha riportato un metodo di allevamento collaborativo per tre gemelli di uistitì⁴³, in cui gli operatori sanitari prendono un bambino al giorno, lo nutrono a mano per tutto il giorno e lo scambiano con un altro dei tre gemelli il giorno successivo. Sebbene questo metodo consenta ai bambini di avere cure parentali, richiede un caregiver esperto per afferrare il bambino dal corpo dei genitori ogni giorno ed è ad alta intensità di lavoro. Finora, nessuno studio ha riportato un metodo di allevamento manuale dettagliato e graduale per gli uistitì appena nati.

L'obiettivo del presente studio è quello di fornire un metodo di allevamento manuale per coloro che sono interessati allo sviluppo dell'uistitì ma con risorse limitate. A differenza del precedente metodo di allevamento collaborativo⁴³, il metodo attuale è un'alternativa che causa meno disturbo alla famiglia del bambino ed è facile da imparare. Sulla base delle regole di base dell'allattamento al seno e di 5 anni di pratica, questo documento descrive un metodo di allevamento manuale per allevare i cuccioli di uistitì che include la preparazione del cibo, un calendario per l'alimentazione, la configurazione della temperatura e dell'umidità dell'incubatrice dell'animale, nonché l'adattamento dei cuccioli all'ambiente della colonia.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato per l'uso e la cura degli animali dell'Università di Zhejiang e hanno seguito le linee guida del National Institutes of Health (NIH).

1. Abitazioni e allevamento⁴⁴

1. Impostare la stanza della colonia con un ciclo giorno/notte di 12 h:12 h, la temperatura a 26-28 °C e l'umidità relativa al 45%-55%.
2. Accoppia gli uistitì maschi e femmine di età compresa tra i 2 e i 6 anni e tienili in gabbie (850 mm x 800 mm x 800 mm) con spazio sufficiente e aria fresca con un sistema di ventilazione 24 ore su 24.
3. Fornire tavole di riposo, altalene, posatoi e amache nelle gabbie.
4. Nutri la coppia di uistitì con acqua fresca e 30-40 g di cibo due volte al giorno, inclusi cereali, uova, patate dolci, miele, frutta, verdura e vermi della farina.
   NOTA: I veterinari e gli sperimentatori devono ispezionare la struttura dell'animale almeno una volta al giorno per assicurarsi che eventuali individui malati vengano diagnosticati e trattati immediatamente.

2. Preparazione prima della nascita dei cuccioli di uistitì

1. Prenditi cura degli uistitì gravidi
   NOTA: Il momento del concepimento è stato diagnosticato mediante palpazione (tipicamente 10-20 giorni dopo l'inizio del periodo embrionale), e abbiamo anche fatto riferimento alla storia riproduttiva dei soggetti animali.
   1. Fornire uno spazio più ampio e il minimo disturbo umano per le coppie riproduttive.
   2. Nutrire le coppie riproduttive con cibo aggiuntivo come vermi della farina, uova, yogurt e frutta secca per garantire nutrimento alle femmine.
   3. Prenditi cura e controlla frequentemente gli uistitì gravidi per prepararli al parto.
      NOTA: Il periodo di gestazione dell'uistitì è stimato in 148 giorni ± 4,3 giorni⁴⁵.
2. Preparare i seguenti oggetti: un'incubatrice per animali (855 mm [L] x 470 mm [L] x 440 mm [A]), assorbenti per pannolini usa e getta (taglie M/L), salviette per neonati, peluche (Figura 1A), rulli giocattolo (Figura 1B), strutture per arrampicarsi (Figura 1B), coperte (10 cm х 10 cm, Figura 1C) e una bilancia elettronica (precisione di 0.2 g, Figura 1F).
   NOTA: Per evitare che gli animali rimangano appesi, i peluche non devono avere strutture ad anello.
3. Preparazione degli alimenti e degli apparecchi per l'alimentazione
   1. Preparare i seguenti articoli: latte artificiale (adatto per bambini di età compresa tra 0 e 12 mesi), pasta di riso per bambini (adatta per bambini di età compresa tra 0 e 6 mesi), bollitore elettrico per l'acqua, bicchiere (100 ml), termoforo, piatto di pesata in plastica (80 mm x 80 mm x 22 mm, Figura 1D), provette sterili sterili (50 ml), siringhe sterili monouso (1-5 ml), iniettori endovenosi (per nippli di alimentazione su misura) (Figura 1E), e tamponi (80-100 cm).
      NOTA: Per realizzare una tettarella per l'alimentazione, viene praticato un taglio a 1 cm dall'estremità di un iniettore endovenoso collegato a una siringa (Figura 1E).
4. Preparazione del modulo di registrazione
   1. Preparare un modulo, di solito lungo diverse pagine, per ogni cucciolo di uistitì per registrare le informazioni di base come il nome, la data di nascita, il peso alla nascita, i genitori, altre informazioni di base di interesse come la circonferenza della testa e la lunghezza della coda, le informazioni sull'allevamento come la data e l'ora di riproduzione, la quantità (ml) dell'assunzione di cibo, lo stato di defecazione (sì/no, duro/sciolto) e la temperatura e l'umidità dell'incubatrice.
      NOTA: Di solito, il peso corporeo viene misurato e registrato due volte al giorno, una volta prima del primo pasto e una volta prima dell'ultimo pasto.

Figura 1: Foto degli oggetti nell'incubatrice e degli strumenti e accessori di alimentazione. (A) Giocattoli di peluche; (B) rotelle giocattolo e strutture per arrampicarsi; (C) coperta; (D) piatto di pesata in plastica; (E) iniettore endovenoso e siringa con una tettarella di alimentazione su misura; (F) bilancia elettronica; (G) caregiver con dispositivi di protezione individuale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Procedura di allevamento a mano

1. Pulisci e sterilizza la stanza prima della data di scadenza.
   1. Spruzzare acido ipocloroso o alcol etilico al 75% sul pavimento e sul tavolo, lasciare agire per 30 secondi, quindi pulire il tavolo e pulire il pavimento.
2. Impostare la temperatura dell'incubatrice a 35 °C e l'umidità al 40%. Di solito, per simulare il fabbisogno di temperatura di base dei cuccioli di uistitì, come mostra la Tabella 1 , prima del 14° giorno postnatale (P14), mantenere la temperatura dell'incubatrice a 35 °C e, dal P15 in poi, abbassare la temperatura di 0,5 °C ogni 3 giorni. Mantenere l'umidità al 40%-45% all'interno dell'incubatrice, che è vicina all'umidità della colonia e mantiene asciutto il pelo dei neonati.
3. Piastrellare un assorbente per pannolini usa e getta per coprire il telaio dell'incubatrice.
4. Per ridurre al minimo lo stress dei neonati, metti un paio di coperte e peluche nell'incubatrice prima di introdurre gli uistitì neonati, che tendono a imitare gli uistitì adulti.
   NOTA: Le coperte e i peluche vengono messi nella gabbia domestica delle coppie riproduttive per 1 giorno prima dell'uso.
5. Metti i cuccioli di uistitì nell'incubatrice e mettili sui peluche una volta separati dai loro genitori nella gabbia di casa.
   NOTA: Per evitare l'isolamento sociale e in accordo con il benessere degli animali, generalmente, due neonati vengono scelti insieme per l'allevamento manuale.
   1. Indossare dispositivi di protezione individuale sterilizzati (DPI, Figura 1G) prima di allattare.
   2. Scaldare un paio di coperte a 35 °C.
   3. Tenere delicatamente il cucciolo di uistitì con coperte calde e ottenere il peso dell'animale come peso alla nascita.
   4. Trasferisci il cucciolo di uistitì nell'incubatrice con coperte calde.
   5. Prendere i record, come indicato nel passaggio 2.4.
6. Frullare gli ingredienti alimentari e nutrire il cucciolo di uistitì.
   1. Sciogliere 5 g di latte in polvere per neonati in 30 ml di acqua bollita a 50 °C in una provetta da centrifuga sterile da 50 mL.
      NOTA: I cuccioli di uistitì a diverse età postnatali hanno bisogno di ricette alimentari diverse. La Tabella 2 include i diversi dosaggi di latte artificiale, pasta di riso e acqua in età postnatale da P1 a P60. Il dosaggio è solitamente sufficiente per 1 giorno. Frullare gli ingredienti prima del primo pasto e conservare il resto degli alimenti in frigorifero a 4 °C. Riscaldare il cibo a 30-35 °C per ogni pasto.
   2. Prelevare 1 ml di cibo con una siringa da 1 ml e coprire la siringa con una tettarella personalizzata.
      NOTA: Selezionare una siringa della dimensione corretta, facendo riferimento alla Tabella 2.
   3. Mantenere la temperatura degli alimenti a 30-35 °C con il termoforo.
   4. Scaldare le mani prima di allattare e tenere delicatamente il cucciolo di uistitì con una coperta calda in una mano nell'incubatrice.
   5. Mettere la tettarella nella bocca del cucciolo di uistitì mentre la testa del cucciolo di uistitì viene tenuta delicatamente con il pollice e l'indice della mano che lo tiene e spingere lentamente il cibo fuori dalla siringa a velocità costante.
      NOTA: Non spingere mai il cibo più velocemente di quanto deglutisca il cucciolo di uistitì. Spingere velocemente può causare soffocamento, con il cibo che esce dal naso attraverso la gola. Ciò può causare malattie come la polmonite, che può persino portare alla morte. Se il cibo trabocca, il cucciolo di uistitì farà fatica. Ogni volta che ciò accade, smetti di nutrirlo e pulisci con cura il cibo dal muso dell'animale. Continuare a nutrirsi dopo che l'uistitì ha iniziato a comportarsi normalmente.
7. Dopo che il cucciolo di uistitì ha consumato una quantità adeguata di cibo, puliscigli l'ano con un tampone con acqua tiepida, che pulisce l'ano e favorisce la defecazione.
8. Osserva l'animale per alcuni minuti e controlla la locomozione e la defecazione dell'animale.
9. Registrare il tempo di alimentazione, la quantità (ml) di cibo assunto, lo stato di defecazione (sì/no, duro/sciolto) e la temperatura e l'umidità dell'incubatrice.
   NOTA: Avvolgere il cucciolo di uistitì con coperte calde durante la pesatura per evitare che il bambino si raffreddi o si ferisca.
10. Mantieni pulito il telaio dell'incubatrice raccogliendo le feci solide o passando a un nuovo assorbente per pannolini usa e getta.
11. Prima di P50, nutrire il cucciolo di uistitì seguendo i passaggi 3.3-3.7 e utilizzare il dosaggio degli ingredienti alimentari e il tempo e la frequenza di alimentazione indicati nella Tabella 2.
12. Da P50 in poi, il cucciolo di uistitì è di solito pronto per il pasto volontario.
    1. Utilizzare piatti di plastica per pesare al posto delle siringhe. Preparare il cibo mescolando gli ingredienti alimentari direttamente nel piatto; fare riferimento alla tabella 2 per gli importi.
    2. Metti il piatto per alimenti nell'incubatrice e fissa il fondo nel caso in cui sia capovolto. Osservate per qualche minuto per assicurarvi che i cuccioli di uistitì mangino il cibo. Per le prime volte, guida l'animale a mangiare volontariamente attirando l'animale verso il piatto del cibo e guidando la sua bocca a toccare il cibo più volte.
       NOTA: Non lasciare mai che il naso dell'animale tocchi il cibo. Di solito, l'animale impara a mangiare volontariamente in 1 giorno.

4. Acclimatazione prima del ritorno dei cuccioli di uistitì alla colonia

NOTA: Di solito, l'allevamento manuale termina quando i cuccioli di uistitì imparano a mangiare da soli. Ci sono alcune procedure di adattamento da eseguire prima di essere restituiti alla gabbia di casa nella colonia di uistitì.

1. Spostare i cuccioli di uistitì dall'incubatrice per animali a piccole gabbie (45 cm x 45 cm x 40 cm), che sono simili a una gabbia per uccelli. Appendi una bottiglia d'acqua (50 ml) su ogni piccola gabbia.
2. Trasferisci le gabbie piccole con i cuccioli di uistitì nella colonia e posizionale vicino alla gabbia di famiglia.
3. Nutrire i cuccioli di uistitì separatamente con un piatto di plastica per 1 settimana, mescolando il cibo secondo le ricette giornaliere preparate per l'intera colonia.
4. Prendi nota del peso corporeo e dello stato di defecazione una volta al giorno.

5. I cuccioli di uistitì che tornano nella gabbia di famiglia

NOTA: Dopo aver vissuto nella piccola gabbia per 7-10 giorni, i cuccioli di uistitì di solito si adattano bene all'ambiente della colonia e non mostrano più ansia.

1. Rimetti i cuccioli di uistitì nella gabbia di famiglia al mattino.
2. Osserva gli animali per almeno 15 minuti per assicurarti che non ci siano morsi, combattimenti o inseguimenti tra i membri della famiglia e i nuovi arrivati.
   NOTA: In caso di morsi, risse o inseguimento, separare il bambino dagli altri il prima possibile; e cercare di restituire il bambino alla sua famiglia ancora una volta in un altro giorno. Se il fallimento si ripresenta, scegli un'altra famiglia che lo prenda in affido. I gruppi familiari che hanno una ricca esperienza genitoriale sono la prima scelta per l'affido. Metti un peluche in una nuova gabbia per accompagnare la scimmia se nessuna famiglia lo accetta.
3. Smetti di nutrire i cuccioli di uistitì separatamente e inizia a nutrirli usando la dieta per la colonia.
4. Prestare molta attenzione all'attività dei cuccioli di uistitì per 1 settimana dopo il loro ritorno nella gabbia di famiglia.
5. Misura il peso corporeo dei cuccioli di uistitì ogni 2 giorni e fai un annotamento. Se perdono peso, nutriteli con cibo extra nutriente con una siringa nella gabbia di famiglia.
6. Fornire cure quotidiane ai cuccioli di uistitì, come per gli uistitì della colonia.

Risultati

Il peso corporeo è un indice chiave dello sviluppo corporeo animale e viene utilizzato come indicatore dello stato di salute degli uistitì in questo protocollo. In questo lavoro, il peso corporeo degli animali allevati a mano è aumentato gradualmente con l'età (Figura 2A, n = 16), in modo simile al peso dei neonati in un precedente studio⁴⁶. Per ridurre al minimo il disturbo alle famiglie riproduttrici della colonia, non abbiamo pesato i cuccioli di uistitì nella...

Discussione

L'uistitì comune è un modello NHP molto utile per la ricerca biomedica e neuroscientifica. Tuttavia, le risorse di uistitì sono troppo limitate per soddisfare le esigenze in rapida crescita. In questo lavoro, abbiamo sviluppato un metodo di allevamento manuale che non solo aumenta il tasso di sopravvivenza dei neonati di uistitì, ma offre anche l'opportunità di studiare il loro sviluppo postnatale. Questo metodo di allevamento manuale è pratico e facile da imparare ed è, quindi, facilmente applicabile ad altri lab...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
animal incubator	RCOM, Korea		MX - BL600N, 855 mm (W) x 470 mm (L) x 440 mm (H)
baby milk powder	Meadjohnson, America		suitable for 0-12 months of age, executive standard - GB25596
baby rice paste	HEINZ, China		suitable for 0-6 months of age, executive standard - GB10769
baby wipes	babycare, China		soft
beaker	ShuNiu, China		100 mL
blankets	Grace, China		10 cm × 10 cm, soft
climbing frame	WowWee, China		firm and no small circular structures
disposable diaper pads	Hi Health Pet, China		either M or L size
disposable sterile syringe	Cofoe, China		1 mL, 2.5 mL, 3 mL, 5 mL, 10 mL
electronic scale	YouSheng, China		measuring range from 0 to 6,000 g with precision of 0.2 g
intravenous injector	HD, China		0.55 mm x 20 mm needle
kettle	FGA, China		warm-keeping kettle 1,500 mL
lactulose	BELCOL, China		to solve constipation
plastic weighing dish	SKSLAB, China		80 mm x 80 mm x 22 mm, used as a bowl
plush toy	Lebiyou, China		soft
probiotic powder	G-Pet, China		to regulate gastrointestinal environment
sterile centrifuge tube	NEST, China		50 mL
swab	OYEAH, China		80 - 100 mm
toy roller	WowWee, China		firm and no small circular structures