Legatura atriale sinistra nell'embrione aviario come modello per l'alterato carico emodinamico durante lo sviluppo vascolare precoce

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo visivo dettagliato per l'esecuzione del modello di legatura atriale sinistra (LAL) nell'embrione aviario. Il modello LAL altera il flusso intracardiaco, che modifica il carico di sollecitazione da taglio della parete, imitando la sindrome del cuore sinistro ipoplasico. Viene presentato un approccio per superare le sfide di questo difficile modello di microchirurgia.

Abstract

Grazie alla sua configurazione ventricolare matura a quattro camere, alla facilità di coltura, all'accesso all'imaging e all'efficienza, l'embrione aviario è un modello animale vertebrato preferito per lo studio dello sviluppo cardiovascolare. Gli studi che mirano a comprendere lo sviluppo normale e la prognosi dei difetti cardiaci congeniti adottano ampiamente questo modello. Vengono introdotte tecniche chirurgiche microscopiche per alterare i normali modelli di carico meccanico in uno specifico momento embrionale e tracciare la cascata molecolare e genetica a valle. Gli interventi meccanici più comuni sono la legatura della vena vitellina sinistra, il bendaggio conotruncale e la legatura atriale sinistra (LAL), che modula la pressione vascolare intramurale e lo stress da taglio della parete dovuto al flusso sanguigno. La LAL, in particolare se eseguita in ovo, è l'intervento più impegnativo, con rese di campione molto ridotte a causa delle operazioni microchirurgiche sequenziali estremamente fini. Nonostante il suo alto rischio, in ovo la LAL è molto preziosa dal punto di vista scientifico in quanto imita la patogenesi della sindrome del cuore sinistro ipoplasico (HLHS). L'HLHS è una cardiopatia congenita complessa clinicamente rilevante osservata nei neonati umani. Un protocollo dettagliato per l'in ovo LAL è documentato in questo documento. In breve, gli embrioni aviari fecondati sono stati incubati a 37,5 °C e al 60% di umidità costante fino a quando non hanno raggiunto gli stadi di Hamburger-Hamilton (HH) da 20 a 21. I gusci delle uova sono stati aperti e le membrane esterne e interne sono state rimosse. L'embrione è stato ruotato delicatamente per esporre il bulbo atriale sinistro dell'atrio comune. I micro-nodi pre-assemblati da suture di nylon 10-0 sono stati delicatamente posizionati e legati attorno alla gemma atriale sinistra. Infine, l'embrione è stato riportato nella sua posizione originale e LAL è stato completato. I ventricoli normali e quelli strumentati con LAL hanno dimostrato differenze statisticamente significative nella compattazione dei tessuti. Un'efficiente pipeline di generazione di modelli LAL contribuirebbe a studi incentrati sulla manipolazione meccanica e genetica sincronizzata durante lo sviluppo embrionale delle componenti cardiovascolari. Allo stesso modo, questo modello fornirà una fonte di cellule perturbate per la ricerca sulle colture tissutali e la biologia vascolare.

Introduzione

I difetti cardiaci congeniti (CHD) sono disturbi strutturali che si verificano a causa di uno sviluppo embrionale anormale¹. Oltre alle condizioni genetiche, la patogenesi è influenzata da un alterato carico meccanico ^2,3. La sindrome del cuore sinistro ipoplasico (HLHS), una cardiopatia congenita, provoca un ventricolo/aorta sottosviluppato alla nascita⁴ con un alto tasso di mortalità ^5,6. Nonostante i recenti progressi nella sua gestione clinica, la crescita vascolare e le dinamiche di sviluppo dell'HLH....

Protocollo

Le uova di Livorno bianco fertile sono ottenute da fornitori di fiducia e incubate secondo linee guida approvate dall'università. Gli embrioni di pulcino, stadi da 18 (giorno 3) a 24 (giorno 4) (gli stadi presentati in questo articolo) non sono considerati animali vertebrati vivi dalla direttiva dell'Unione Europea (UE) 2010/63/UE e dalle linee guida del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) negli Stati Uniti. Gli embrioni di pulcino sono considerati "animali vivi" dopo il 19° giorno di incubazione secondo le leggi statunitensi, ma non per l'UE. Ogni uovo è etichettato con la data di inizio della schiusa ed è programmato per schiudersi entro....

Discussione

Nell'HLHS, il flusso sanguigno è alterato a causa di difetti strutturali, che portano a una morfologia anomala sul lato sinistro ^4,6. Il presente modello fornisce un sistema sperimentale pratico per comprendere meglio la progressione dell'HLHS e può anche imitare la sua patogenesi⁸. Tuttavia, stabilire un modello animale HLHS completamente equivalente dal punto di vista clinico è un compito impegnativo. Oltre al modello LAL aviario qui .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 nylon surgical suture	Ethicon
Elastica van Gieson staining kit	Sigma-Aldrich	115974	For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute	Interlab	64-17-5	For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
Kimwipes	Interlab	080.65.002
Microscissors	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk	Leica Biosystems	39602012	Tissue embedding medium
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	Used at station 1
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4)	Adumont & Fils, Switzerland		Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	Used to remove the membranes on the embryo