Creazione di un modello murino di fistola oronasale

Riepilogo

Questo articolo delinea una procedura passo passo per stabilire un modello di topi con una fistola oronasale. La fistola oronasale è stata creata impiegando un cauterizzatore oftalmologico riscaldato per danneggiare la porzione mediana del palato duro, con conseguente formazione di un'apertura tra le cavità orali e nasali.

Abstract

Questo studio presenta un metodo che utilizza il cauterizzazione oftalmologica riscaldata per sviluppare un modello praticabile per lo studio delle fistole oronasali. I topi C57BL/6 sono stati utilizzati per stabilire il modello di fistola oronasale (ONF). Per creare l'ONF, i topi sono stati anestetizzati e immobilizzati e i loro palati duri sono stati esposti. Durante la procedura chirurgica, è stata indotta una lesione della mucosa a tutto spessore di 2,0 x 1,5 mm nella linea mediana del palato duro utilizzando la cauterizzazione oftalmologica. Era fondamentale controllare le dimensioni dell'ONF e ridurre al minimo il sanguinamento per garantire il successo dell'esperimento. La verifica dell'efficacia del modello ONF è stata condotta il 7° giorno dopo l'intervento, comprendendo sia valutazioni anatomiche che funzionali. La presenza del setto nasale all'interno della cavità orale e il deflusso di acqua sterile dalle narici al momento dell'iniezione nella cavità orale hanno confermato il successo del modello ONF. Il modello ha dimostrato una fistola oronasale pratica e di successo, caratterizzata da un basso tasso di mortalità, variazioni di peso significative e variazioni minime nelle dimensioni dell'ONF. Studi futuri potrebbero prendere in considerazione l'adozione di questa metodologia per chiarire i meccanismi di guarigione delle ferite del palato ed esplorare nuovi trattamenti per le fistole oronasali.

Introduzione

La fistola oronasale (ONF), un'apertura anomala tra la cavità orale e quella nasale, si manifesta clinicamente come un difetto in un'area strutturale dal processo alveolare all'ugola, che si verifica comunemente come complicanza dopo la riparazione della palatoschisi¹. I pazienti con ONF soffrono di reflusso alimentare, disturbi articolari e compromissione della funzione velofaringea, con un impatto significativo sulla qualità della vita ^2,3,4. Il tasso di ONF post-operatoria varia dal 2,4% al 55% a causa di fattori quali la larghezza della schisi, il tipo di Veau e il metodo chirurgico 5,6,7,8. Inoltre, il tasso di recidiva dopo la riparazione dell'ONF è elevato, compreso tra lo 0% e il 43%^9.

Diversi nuovi trattamenti si sono recentemente dimostrati promettenti nel campo dell'ONF, tra cui diversi materiali, farmaci e nuove tecniche 10,11,12,13,14,15,16,17. Una valutazione accurata degli effetti terapeutici è essenziale in quanto fornisce la base per la selezione e l'ulteriore sviluppo dei trattamenti per l'ONF. Tuttavia, ottenere una valutazione valida a breve termine per gli effetti terapeutici diversi dalla chirurgia è difficile, poiché le caratteristiche degli ONF variano tra i diversi pazienti. Pertanto, è necessario stabilire un modello di malattia ONF per verificare l'efficacia di questi metodi di trattamento.

Per diversi decenni, i ricercatori hanno generato il modello della fistola oronasale (ONF) in varie specie animali, tra cui ratti^18,19, suinetti^20,21, minipig²² e cani^23, poiché queste specie possiedono un palato duro sostanziale adatto alla manipolazione chirurgica. Tuttavia, i topi hanno una sequenza genetica e un intero genoma simili a quelli degli esseri umani, il che li rende un modello importante per la ricerca e lo sviluppo di nuovi farmaci^24,25,26. Inoltre, i topi offrono poche variazioni da lotto a lotto, il che li rende una scelta favorevole per stabilire il modello ONF^12,13,27.

Tuttavia, i passaggi dettagliati per la creazione di ONF non sono stati descritti e la stabilità delle dimensioni ONF non è stata presa in considerazione. Inoltre, la verifica della formazione di ONF si basava esclusivamente sull'osservazione²⁸, senza garantire la comunicazione diretta tra la cavità orale e quella nasale. Non è stato dimostrato con altri mezzi, come la perdita di peso corporeo del topo a causa delle difficoltà alimentari causate dall'ONF. Inoltre, non è stata presa in considerazione la normale variazione delle dimensioni della ferita, che è fondamentale per gli studi su farmaci o materiali che promuovono o inibiscono la guarigione della ferita. Pertanto, vi è una forte necessità di stabilire un modello ONF stabile e convalidato.

L'obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare un modello pratico di ONF che affronti le questioni di cui sopra, con la speranza che questo protocollo serva come base per la ricerca futura sui meccanismi di guarigione delle ferite palatali e nuovi trattamenti per l'ONF.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali in questo studio sono state esaminate e approvate dal Comitato Etico della Scuola di Stomatologia della Cina Occidentale, Università del Sichuan. Per il presente studio sono stati utilizzati topi adulti C57BL/6 (femmine).

1. Preparazione chirurgica

1. Raccogli gli strumenti chirurgici necessari per la procedura: germinatore, cauterizzazione oftalmologica, forbici microchirurgiche, pinzette microchirurgiche, siringhe e aghi (26 g x 0,63 pollici) (Figura 1A,B) (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: Prima della procedura chirurgica, sterilizzare in autoclave gli strumenti chirurgici, inclusi il cauterizzatore oftalmologico, le pinzette microchirurgiche e le forbici microchirurgiche, a 102,9 kPa (1,05 kg/cm²) e 121 °C per 20 minuti.
2. Raccogliere le forniture chirurgiche necessarie: teli chirurgici, guanti in lattice, cotone sterile, fogli sterili, fogli di metallo sterili, pannelli di schiuma come piattaforma chirurgica, elastici (che possono essere ottenuti strappando un guanto in lattice medico) e nastro adesivo (Figura 1C) (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: Utilizzare un set separato di materiali di consumo per ciascun topo, comprese siringhe e fogli sterili per il campo chirurgico.
3. Pulire l'area chirurgica e l'apparecchio (sorgente luminosa, pannello in schiuma e dispositivo di mantenimento della temperatura, vedere la tabella dei materiali) utilizzando salviette imbevute di alcol. Coprire le manopole e le maniglie degli strumenti che potrebbero essere necessari durante la procedura con un foglio di metallo sterile.
4. Aprire in modo asettico i singoli strumenti e posizionarli con cura nell'area chirurgica. Attivare il germinatore (vedi Tabella dei materiali) e le luci per l'uso durante la procedura. Mettere il cauterizzazione oftalmologica nel germinatore e riscaldarlo a 250 °C per 20 min.

2. Procedura chirurgica

1. Eseguire la fissazione del mouse e aprire la cavità orale seguendo i passaggi seguenti.
   1. Selezionare una femmina di topo C57BL/6J del peso di 20-25 g e di 8-12 settimane. Tenere a casa il topo per 7 giorni prima di eseguire qualsiasi procedura.
   2. Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di Zoletil50 (80 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) (vedere Tabella dei materiali). Applicare un unguento oftalmico per gli occhi sull'occhio del topo. Attendi fino a quando non c'è una risposta di pizzicamento delle dita dei piedi.
      NOTA: Il mouse è pronto per la procedura quando non è in grado di capovolgersi autonomamente.
   3. Fissare il mouse a un pannello di schiuma rivestito con fogli sterili. Utilizzare del nastro adesivo per legare il mouse alla piattaforma chirurgica in posizione supina (Figura 2A).
   4. Aprire la cavità orale del topo. Posizionare due aghi (26 g x 0,63 pollici) davanti al piano orbitale dell'orecchio e altri due dietro di esso. Metti un elastico intorno agli aghi e incrocia gli incisivi per tenere la bocca aperta. Utilizzare una pinzetta microchirurgica per aprire gli angoli della bocca (Figura 2B).
      NOTA: Assicurarsi che il palato duro sia chiaramente esposto. Fissare la linguetta sotto l'elastico per evitare l'ostruzione del campo visivo e il bruciore durante gli esperimenti successivi.
2. Creare la fistola oronasale (ONF) sul palato duro (Figura 3A-F).
   1. Recuperare il cauterizzazione oftalmologica, che è stato riscaldato a 250 °C per 20 min. Posizionare la punta del cauterismo a 1 mm di distanza dall'intersezione tra la linea mediana del palato e la linea del primo premolare, creando una lesione della mucosa a tutto spessore al palato duro nella linea mediana.
      NOTA: Evitare di scottare la lingua del mouse.
   2. Dopo alcuni secondi, rimuovere il cauterismo oftalmologico quando la mucosa intorno alla punta del cauterio diventa bianca.
   3. Posizionare il cauterizzazione oftalmologica nel germinatore e continuare a riscaldarlo a 250 °C per 10 min. Ripetere il passaggio precedente per allargare la ferita lungo i bordi fino a raggiungere una lunghezza di 2,0 mm e una larghezza di 1,5 mm.
      NOTA: Ogni estensione deve seguire il bordo dell'ultima lesione. Usa un calibro a corsoio per misurare la lunghezza e la larghezza della lesione. La lesione dovrebbe coprire il 10% del palato.
   4. Utilizzare forbici microchirurgiche per rimuovere i tessuti molli denaturati in eccesso intorno alla ferita. Utilizzare cotone sterile per fermare l'emorragia e prevenire l'asfissia per inalazione del topo. Misurare la ferita per assicurarsi che formi una lesione della mucosa del palato duro a tutto spessore che misura 2,0 x 1,5 mm nella linea mediana.

3. Cure post-operatorie

1. Somministrare Meloxicam al topo al momento del risveglio postoperatorio, alla dose di 5 mg/kg/die per 3 giorni, per via sottocutanea²⁹.
2. Posizionare il mouse su un dispositivo di mantenimento della temperatura fino a quando non riprende completamente conoscenza.
   NOTA: Assicurarsi che il mouse sia posizionato in modo da facilitare la respirazione. Ruotare i topi ogni 10-15 minuti per prevenire il ristagno di sangue o il collasso dei lobi polmonari. Una volta che il topo si è riscaldato, rimettilo nella sua gabbia. Fornire gelatina sterile e mangime irradiato sul fondo della gabbia per i topi.

4. Verifica della creazione della fistola oronasale

NOTA: Il successo della creazione della fistola oronasale (ONF) viene valutato il 7° giorno successivo alla procedura chirurgica.

1. Preparare le forniture chirurgiche necessarie: elastico, nastro adesivo, siringhe, teli chirurgici, guanti in lattice, fogli sterili, fogli di metallo sterili e pannelli di schiuma.
2. Indossare teli chirurgici e guanti sterili per mantenere le condizioni asettiche. Disinfettare il pannello in schiuma, la fonte di luce e il dispositivo di mantenimento della temperatura con alcol.
3. Indurre l'anestesia generale mediante iniezione intraperitoneale di Zoletil50 (80 mg/kg). Attendi fino a quando non c'è una risposta di pizzicamento delle dita dei piedi. Utilizzare lo stesso metodo descritto nei passaggi 2.1.3 e 2.1.4 per immobilizzare il mouse ed esporre il palato duro.
4. Eseguire la verifica strutturale anatomica assicurandosi che il setto sia ancora visibile nel sito della ferita, indicando la corretta creazione di ONF (Figura 4A,B).
5. Eseguire la verifica funzionale: chiudere la cavità orale del topo e iniettare acqua sterile nella sua cavità orale utilizzando una siringa sterile. Il successo della creazione di ONF è confermato quando il fluido scorre dalle narici del topo.
6. Posizionare il mouse sul dispositivo di mantenimento della temperatura (37 °C) fino a quando non riprende completamente conoscenza. Ruotare i topi ogni 10-15 minuti per prevenire il ristagno di sangue o il collasso dei lobi polmonari.

Risultati

Per valutare la fattibilità e la stabilità di questo metodo sperimentale, la stessa procedura è stata eseguita su dieci topi e sono state fatte osservazioni riguardanti la mortalità, i cambiamenti nelle dimensioni della ferita, il peso corporeo e l'analisi istologica. I topi sono stati soppressi il giorno 7.

La procedura ha mostrato un basso tasso di mortalità. Il cauterizzazione oftalmologica e il germinatore, raffigurati nella Figura 1A-C

Discussione

I ricercatori hanno esplorato vari materiali, farmaci e nuove tecniche per il trattamento dell'ONF 10,11,12,13,14,15,16,17. Con i progressi nelle procedure chirurgiche, l'incidenza e la recidiva di ONF sono state ridotte. Tuttavia, a causa delle caratterist...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Germinator	Electron Microscopy Sciences	66118-20	Heating and disinfection equipment
Latex gloves	Allmed		or similar
Lights	Olympus	A1813
Meloxicam	MedChemExpress	HY-B0261	crushed; 5 mg/kg
Microsurgical instruments (scissors and tweezers)	Jiangsu Tonghui Medical Devices Co.	M-Y-0087	Surgical instrument
Ophthalmologic cautery	Suqian Wenchong Medical Equipment Co.	1.00234E+13	Surgical instrument
Sterile cotton,	Yancheng Begu Technology Co.		or similar
Sterile metal foil	Biosharp		or similar
Sterile sheets	3M	XH003801129	or similar
Surgical drapes	Yancheng Begu Technology Co.		or similar
Syringes	Yancheng Begu Technology Co.	S-015301	or similar
Tape	Bkmamlab		or similar
Temperature maintenance device	Harvard Apparatus	LE-13-2104
Zoletil50	Virbac		80 mg/kg