Determinazione dell'attività procoagulante della vescicola extracellulare (EV) utilizzando il tempo di coagulazione attivato da EV (EV-ACT)

Riepilogo

Questo protocollo studia l'uso del plasma ricco di vescicole extracellulari (EV) come indicatore della capacità coagulativa delle vescicole extracellulari. Il plasma ricco di EV si ottiene attraverso un processo di centrifugazione differenziale e successiva ricalcificazione.

Abstract

Il ruolo delle vescicole extracellulari (EV) in varie malattie sta guadagnando sempre più attenzione, in particolare a causa della loro potente attività procoagulante. Tuttavia, c'è un urgente bisogno di un test al letto del paziente per valutare l'attività procoagulante delle vescicole extracellulari in ambito clinico. Questo studio propone l'uso del tempo di attivazione della trombina del plasma ricco di EV come misura dell'attività procoagulante di EV. Sono state impiegate procedure standardizzate per ottenere sangue intero citrato di sodio, seguite da centrifugazione differenziale per ottenere plasma ricco di EV. Il plasma ricco di EV e il cloruro di calcio sono stati aggiunti alla coppetta di prova e le variazioni della viscoelasticità sono state monitorate in tempo reale utilizzando un analizzatore. È stato determinato il tempo di coagulazione naturale del plasma ricco di EV, denominato EV-ACT. I risultati hanno rivelato un aumento significativo dell'EV-ACT quando l'EV è stato rimosso dal plasma ottenuto da volontari sani, mentre è diminuito significativamente quando l'EV è stato arricchito. Inoltre, l'EV-ACT è stato considerevolmente ridotto nei campioni umani di preeclampsia, frattura dell'anca e cancro del polmone, indicando livelli elevati di EV plasmatica e la promozione dell'ipercoagulazione del sangue. Con la sua procedura semplice e rapida, EV-ACT si mostra promettente come test al letto del paziente per valutare la funzione della coagulazione in pazienti con alti livelli plasmatici di EV.

Introduzione

La trombosi, causata dall'ipercoagulabilità, svolge un ruolo significativo in varie malattie, tra cui il trauma cerebrale¹, la pre-eclampsia², i tumori³ e i pazienti con fratture⁴. Il meccanismo alla base dell'ipercoagulabilità è complesso e recentemente è stata posta l'enfasi sul ruolo delle vescicole extracellulari (EV) nei disturbi della coagulazione. Le vescicole extracellulari sono corpi simili a vescicole con una struttura a doppio strato che si staccano dalla membrana cellulare, con un diametro compreso tra 10 nm e 1000 nm. Sono associati a una varietà di processi patologici, in particolare ai disturbi della coagulazione⁵. Diversi studi hanno identificato le vescicole extracellulari come un promettente predittore del rischio di trombosi ^6,7. L'attività procoagulante delle vescicole extracellulari dipende dall'espressione dei fattori della coagulazione, principalmente il fattore tissutale (TF) e la fosfatidilserina (PS). Le vescicole extracellulari con una robusta attività procoagulante migliorano significativamente l'efficienza catalitica della tenasi e del complesso protrombinico, promuovendo così il fibrinogeno mediato dalla trombina e la trombosi locale⁸. Livelli elevati di vescicole extracellulari e la loro relazione causale con l'ipercoagulabilità sono stati osservati in numerose malattie⁹. Di conseguenza, la standardizzazione del rilevamento delle vescicole extracellulari e la segnalazione della loro attività procoagulante è un'importante area di indagine¹⁰.

Ad oggi, sono disponibili solo pochi kit commerciali per rilevare l'attività procoagulante delle vescicole extracellulari. Il saggio MP-Activity e il test MP-TF, prodotti da un'azienda commerciale, sono saggi funzionali utilizzati per misurare l'attività procoagulante di EV nel plasma¹¹. Questi saggi impiegano un principio simile a quello dei saggi di immunoassorbimento enzimatico per rilevare PS e TF sulle vescicole extracellulari. Tuttavia, questi kit sono costosi e limitati a pochi istituti di ricerca di alto livello. Il processo è complesso e richiede molto tempo, il che rende difficile implementarli in ambito clinico. Inoltre, un test di fosfolipidi procoagulanti (PPL) sviluppato commercialmente mescola il plasma privo di PS con il plasma di prova, misurando il tempo di coagulazione per rilevare quantitativamente i livelli di EV PS-positivi¹². Tuttavia, questi saggi si concentrano principalmente su PS e TF sulle vescicole extracellulari, trascurando altre vie di coagulazione in cui le vescicole extracellulari circolanti possono essere coinvolte¹².

Il sistema di coagulazione plasmatica è complesso e comprende sia componenti "invisibili" che "visibili", tra cui coagulanti, anticoagulanti, sistemi fibrinolitici e vescicole extracellulari sospese nel plasma. Fisiologicamente, questi componenti mantengono un equilibrio dinamico. In condizioni patologiche, un aumento significativo delle vescicole extracellulari in circolo contribuisce all'ipercoagulabilità, in particolare nei pazienti con traumi cerebrali, preeclampsia, fratture e vari tipi di cancro¹³. Attualmente, la valutazione dello stato della coagulazione nei laboratori clinici coinvolge principalmente la valutazione del sistema di coagulazione, del sistema anticoagulante e della fibrinolisi 14,15,16,17. Il tempo di protrombina, il tempo di tromboplastina parziale attivata, il tempo di trombina e il rapporto normalizzato internazionale sono comunemente usati per valutare i livelli di fattore della coagulazione nel sistema di coagulazione¹⁸. Tuttavia, studi recenti hanno rivelato che questi test non riflettono pienamente l'ipercoagulabilità di alcune malattie¹⁹. Altri metodi di analisi, come la tromboelastometria (TEG), il TEG rotazionale e l'analisi Sonoclot, misurano le variazioni viscoelastiche del sangue intero^20,21. Poiché i campioni di sangue intero contengono numerose cellule del sangue e piastrine, è più probabile che questi test indichino lo stato di coagulazione del campione nel suo complesso. Alcuni ricercatori hanno riportato il ruolo delle cellule del sangue e delle piastrine nell'attività procoagulante^22,23. Uno studio recente ha anche scoperto che i precedenti test di funzionalità della coagulazione incontrano difficoltà nel rilevare i cambiamenti nell'attività procoagulante delle microparticelle²⁴. Pertanto, è stata proposta l'ipotesi che la funzione procoagulante delle vescicole extracellulari possa essere valutata mediante misurazioni viscoelastiche del tempo di coagulazione attivato (ACT) nel plasma ricco di vescicole.

Protocollo

La raccolta di campioni umani è stata approvata dal Comitato Etico Medico dell'Ospedale Generale dell'Università Medica di Tianjin. La raccolta del sangue venoso umano ha seguito rigorosamente le linee guida emesse dalla Commissione sanitaria nazionale cinese, ovvero WS/T 661-2020 Guideline for Collection of Venous Blood Specimens. In breve, il sangue è stato raccolto da individui sani con il consenso informato dalla vena dell'area brachiale anteriore e i campioni sono stati miscelati utilizzando l'anticoagulante citrato di sodio al 3,2% in un rapporto di 1:9. Quando sono stati raccolti solo campioni di anticoagulanti di citrato di sodio, il primo recipiente di raccolta è stato scartato. Il flusso di elaborazione è stato avviato entro 0,5 ore dalla raccolta del campione. Soggetti adulti sani sono stati reclutati per la raccolta del campione dopo aver ottenuto il consenso informato. I criteri di esclusione dei pazienti erano: (1) una recente trombosi intravascolare, (2) compromissione della funzionalità epatica e renale, (3) ipertensione, iperlipidemia, diabete e altre malattie croniche, (4) aspirina o trattamento anticoagulante, (5) mestruazioni e gravidanza.

1. Isolamento di plasma ricco di EV

1. Centrifugare i campioni a 120 x g per 20 minuti a temperatura ambiente per rimuovere le cellule del sangue. Il surnatante è il plasma ricco di piastrine. Quindi, trasferire la metà superiore del surnatante in una nuova provetta da centrifuga con una pipetta.
2. Centrifugare il plasma ricco di piastrine a 1500 x g per 20 minuti a temperatura ambiente per rimuovere le piastrine. Il surnatante è il plasma povero di piastrine. Quindi trasferire la metà superiore del surnatante in una nuova provetta da centrifuga.
3. Centrifugare il plasma povero di piastrine a 13000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente per rimuovere i detriti cellulari. Il surnatante è plasma ricco di EV. Quindi, trasferire la metà superiore del surnatante in una nuova provetta da centrifuga per il test successivo.

2. Rilevamento di EV-ACT del campione da parte dell'analizzatore

1. Accendere l'analizzatore di coaguli (vedere la tabella dei materiali) e preriscaldare lo strumento a 37 °C. Installare la sonda monouso e la tazza di prova, quindi avviare la procedura di controllo qualità della macchina.
   NOTA: Quando il valore del segnale di resistenza viscosa sullo schermo viene visualizzato come una linea retta, significa che il rilevamento non viene interferito e che il controllo di qualità dello stato dell'analizzatore è qualificato. La procedura di test può essere avviata dopo che l'autotest è stato qualificato.
2. Immettere le informazioni di esempio nel sistema. Quindi, trasferire 200 μL di plasma ricco di EV nella coppetta di prova, seguiti da 20 mM 170 μL di cloruro di calcio. Fare clic sul pulsante Start. L'asta di agitazione magnetica nella tazza di prova mescolerà completamente il campione e il cloruro di calcio. Chiudere il coperchio e la sonda inizierà a rilevare la variazione della resistenza del campione.
   NOTA: Al termine del test, l'analizzatore visualizzerà automaticamente "test completato". L'ora di EV-ACT viene visualizzata e registrata dal sistema. Il risultato è espresso nell'unità di tempo "secondo". Gettare la sonda e testare la coppetta.

3. Controllo di qualità basato sulla citometria a flusso del campione di plasma ricco di EV

1. Le vescicole extracellulari sono state identificate per la prima volta in base alle loro dimensioni (0,1-1 μm). Regolare in anticipo i parametri del citometro a flusso e impostare il "gate" di EV utilizzando perle di polistirene disponibili in commercio (0,5, 0,9 e 3,0 μm) (vedere la tabella dei materiali).
   NOTA: La miscela di microsfere è costituita da sfere fluorescenti di diversi diametri che coprono la gamma di dimensioni di microvescicole (0,5 e 0,9 μm) e piastrine (0,9 μm e 3 μm).
2. Regolare la tensione della dispersione diretta e della dispersione laterale e assicurarsi che le microsfere da 0,9 μm cadano nella regione appropriata. La regione EV può essere disegnata in base al diametro della microsfera.
3. Trasferire 50 μL di plasma ricco di EV nel tubo di flusso, seguito da 450 μL di soluzione salina tampone fosfato filtrata. Mescolare accuratamente il liquido nel tubo di flusso. Infine, rilevare i campioni utilizzando la citometria a flusso²⁵.
4. Utilizzare le particelle fluorescenti ultra arcobaleno (vedere la tabella dei materiali) per quantificare il numero di EVs.In brief, aggiungere 10 μL di particelle al campione prima del rilevamento del flusso e calcolare la concentrazione di EV utilizzando la seguente formula al termine del rilevamento del campione: 10.120 * EV (#) / (microsfere * volume) * fattore di diluizione²⁶.

Risultati

Il tempo di attivazione della trombina del plasma ricco di EV è stato misurato utilizzando un analizzatore con metodo viscoelastico per la misurazione del tempo di coagulazione del plasma. La macchina è composta da quattro componenti principali: un convertitore di segnale elettronico, una sonda, un serbatoio di rilevamento e un elemento riscaldante (Figura 1A,B). La sonda utilizza oscillazioni ad alta e bassa ampiezza per rilevare le variazioni della viscosità del plasma....

Discussione

In questo studio è stata descritta la preparazione di plasma ricco di EV e la razionalità del metodo è stata verificata utilizzando la citometria a flusso. Successivamente, i campioni di plasma ricalcificato sono stati analizzati per il tempo di ACT utilizzando un analizzatore di coaguli basato sui principi di viscoelasticità²⁴. Come mostrato nella Figura 3A, è stato riscontrato che la concentrazione di EV ottenuta attraverso l'ultracentrifugazione riduce il temp...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles	3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA		For quantitative detection of MP
Calcium chloride	Werfen (china)	0020006800	20 mM
Century Clot analyzer	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd		The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cup	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometer	BD, USA		Used to detect MP
Megamix polystyrene beads	Biocytex, Marseille, France	7801	The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.