Determinazione dell'attività procoagulante della vescicola extracellulare (EV) utilizzando il tempo di coagulazione attivato da EV (EV-ACT)

Riepilogo

Questo protocollo studia l'uso del plasma ricco di vescicole extracellulari (EV) come indicatore della capacità coagulativa delle vescicole extracellulari. Il plasma ricco di EV si ottiene attraverso un processo di centrifugazione differenziale e successiva ricalcificazione.

Abstract

Il ruolo delle vescicole extracellulari (EV) in varie malattie sta guadagnando sempre più attenzione, in particolare a causa della loro potente attività procoagulante. Tuttavia, c'è un urgente bisogno di un test al letto del paziente per valutare l'attività procoagulante delle vescicole extracellulari in ambito clinico. Questo studio propone l'uso del tempo di attivazione della trombina del plasma ricco di EV come misura dell'attività procoagulante di EV. Sono state impiegate procedure standardizzate per ottenere sangue intero citrato di sodio, seguite da centrifugazione differenziale per ottenere plasma ricco di EV. Il plasma ricco di EV e il cloruro di calcio sono stati aggiunti alla coppetta di prova e le variazioni della viscoelasticità sono state monitorate in tempo reale utilizzando un analizzatore. È stato determinato il tempo di coagulazione naturale del plasma ricco di EV, denominato EV-ACT. I risultati hanno rivelato un aumento significativo dell'EV-ACT quando l'EV è stato rimosso dal plasma ottenuto da volontari sani, mentre è diminuito significativamente quando l'EV è stato arricchito. Inoltre, l'EV-ACT è stato considerevolmente ridotto nei campioni umani di preeclampsia, frattura dell'anca e cancro del polmone, indicando livelli elevati di EV plasmatica e la promozione dell'ipercoagulazione del sangue. Con la sua procedura semplice e rapida, EV-ACT si mostra promettente come test al letto del paziente per valutare la funzione della coagulazione in pazienti con alti livelli plasmatici di EV.

Introduzione

La trombosi, causata dall'ipercoagulabilità, svolge un ruolo significativo in varie malattie, tra cui il trauma cerebrale¹, la pre-eclampsia², i tumori³ e i pazienti con fratture⁴. Il meccanismo alla base dell'ipercoagulabilità è complesso e recentemente è stata posta l'enfasi sul ruolo delle vescicole extracellulari (EV) nei disturbi della coagulazione. Le vescicole extracellulari sono corpi simili a vescicole con una struttura a doppio strato che si staccano dalla membrana cellulare, con un diametro compreso tra 10 nm e 1000 nm. Sono associati a una varietà di processi pa....

Protocollo

La raccolta di campioni umani è stata approvata dal Comitato Etico Medico dell'Ospedale Generale dell'Università Medica di Tianjin. La raccolta del sangue venoso umano ha seguito rigorosamente le linee guida emesse dalla Commissione sanitaria nazionale cinese, ovvero WS/T 661-2020 Guideline for Collection of Venous Blood Specimens. In breve, il sangue è stato raccolto da individui sani con il consenso informato dalla vena dell'area brachiale anteriore e i campioni sono stati miscelati utilizzando l'anticoagulante citrato di sodio al 3,2% in un rapporto di 1:9. Quando sono stati raccolti solo campioni di anticoagulanti di citrato di sodio, il primo recipiente di raccol....

Discussione

In questo studio è stata descritta la preparazione di plasma ricco di EV e la razionalità del metodo è stata verificata utilizzando la citometria a flusso. Successivamente, i campioni di plasma ricalcificato sono stati analizzati per il tempo di ACT utilizzando un analizzatore di coaguli basato sui principi di viscoelasticità²⁴. Come mostrato nella Figura 3A, è stato riscontrato che la concentrazione di EV ottenuta attraverso l'ultracentrifugazione riduce il temp.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles	3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA		For quantitative detection of MP
Calcium chloride	Werfen (china)	0020006800	20 mM
Century Clot analyzer	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd		The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cup	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometer	BD, USA		Used to detect MP
Megamix polystyrene beads	Biocytex, Marseille, France	7801	The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.