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Questo articolo descrive come la microscopia a due fotoni sensibile alla polarizzazione potrebbe essere applicata per caratterizzare l'organizzazione locale all'interno di sovrastrutture-sferuliti amiloidi label-free. Descrive inoltre come preparare e misurare il campione, assemblare la configurazione richiesta e analizzare i dati per ottenere informazioni sull'organizzazione locale delle fibrille amiloidi.
Rispetto alla sua controparte a un fotone, l'eccitazione a due fotoni è vantaggiosa per gli esperimenti di bioimaging a causa della sua minore fototossicità, della penetrazione più profonda nei tessuti, del funzionamento efficiente in sistemi densamente impacchettati e della ridotta fotoselezione angolare dei fluorofori. Pertanto, l'introduzione dell'analisi di polarizzazione nella microscopia a fluorescenza a due fotoni (2PFM) fornisce una determinazione più precisa dell'organizzazione molecolare in un campione rispetto ai metodi di imaging standard basati su processi ottici lineari. In questo lavoro, ci concentriamo sulla 2PFM sensibile alla polarizzazione (ps-2PFM) e sulla sua applicazione nella determinazione dell'ordinamento molecolare all'interno di biostrutture complesse-sferuliti amiloidi. Le malattie neurodegenerative come l'Alzheimer o il Parkinson sono spesso diagnosticate attraverso il rilevamento di aggregati amiloidi-proteici formatisi a causa di un alterato processo di misfolding proteico. L'esplorazione della loro struttura porta a una migliore comprensione del loro percorso di creazione e, di conseguenza, allo sviluppo di metodi diagnostici più sensibili. Questo articolo presenta il ps-2PFM adattato per la determinazione dell'ordinamento locale delle fibrille all'interno delle sferuliti di insulina bovina e degli aggregati proteici amiloidogenici sferici. Inoltre, dimostriamo che la tecnica proposta può risolvere l'organizzazione tridimensionale delle fibrille all'interno della sferulite.
Negli ultimi decenni, sebbene vi sia stato uno sviluppo significativo di numerose tecniche di microscopia a fluorescenza per il bioimaging delle proteine e dei loro aggregati1, solo alcune sono state utilizzate per risolvere il loro ordinamento locale all'interno del campione 2,3. Lamicroscopia a fluorescenza 4 è stata utilizzata per studiare l'eterogeneità strutturale intrinseca delle sovrastrutture-sferuliti amiloidi. Inoltre, la determinazione quantitativa dell'ordinamento locale all'interno di biostrutture complesse e densamente impacchettate come le sferulit....
1. Preparazione dei vetrini del microscopio con sferuliti completamente cresciute
NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, i reagenti e le apparecchiature utilizzati in questo protocollo. Tutte le soluzioni sono state preparate con acqua deionizzata (18,2 MΩ·cm a 25 °C) ottenuta dal sistema di purificazione dell'acqua.
Il protocollo presentato fornisce una guida passo dopo passo attraverso la preparazione delle sovrastrutture amiloidi per il test con ps-2PFM, la costruzione del sistema microscopico e le misurazioni del campione appropriato. Tuttavia, prima della serie finale di misurazioni, è fondamentale allineare correttamente gli APD con un riferimento isotropo, che dovrebbe portare alla raccolta di un segnale simmetrico di forma e intensità simili su entrambi i rivelatori (Figura 4C). Anche le differ.......
La microscopia a due fotoni sensibile alla polarizzazione è uno strumento prezioso per studiare l'ordinamento locale delle fibrille all'interno delle sovrastrutture amiloidi, richiedendo solo piccole modifiche alla configurazione multifotone standard. Poiché opera su fenomeni ottici non lineari, è possibile ottenere una ridotta fotoselezione angolare e una maggiore risoluzione assiale rispetto ai metodi di microscopia a fluorescenza eccitata con un fotone. Inoltre, porta a una minore dispersione della luce, a una mino.......
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto Sonata Bis 9 (2019/34/E/ST5/00276) finanziato dal National Science Centre in Polonia.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sample preparation | |||
Coverslips, 24 x 24 mm | Chemland | 04-298.202.04 | |
DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich | 6522 | Slide mountant |
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene | Chemland | 02-63102 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | Used for spherulite incubation | |
HLP 5UV Water purification system | Hydrolab | Source of dionized water used in sample preparation | |
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), | Sigma-Aldrich | 30721-M | |
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) | Sigma-Aldrich | I5500 | |
Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 270474 | |
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm | Chemland | 04-296.202.09 | |
Olympus BX60 | Olympus | Polarized Optical Microscope used in Figure 2 | |
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 | Chemland | VIT131097 | |
Microscope ps-2PFM setup | |||
Chameleon Ultra II | Coherent | ||
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter | Thorlabs | ||
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter | Thorlabs | ||
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes | ID Quantique | ||
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm | Semrock | ||
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm | Thorlabs | ||
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA | Nikon | ||
piezo 3D stage | Piezosystem Jena | ||
Polarizing Beamsplitter | Thorlabs | ||
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW | Thorlabs | ||
Software | |||
LabView 2018 | National Instruments | Version 18.0.1f2 | |
Matplotlib library | Version 3.3.2 | ||
NumPy library | Version 1.19.2 | ||
SciPy library | Version 1.5.2 | ||
Spyder Python 3 IDE | Version 4.1.5 |
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