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Riepilogo

Questo articolo descrive come la microscopia a due fotoni sensibile alla polarizzazione potrebbe essere applicata per caratterizzare l'organizzazione locale all'interno di sovrastrutture-sferuliti amiloidi label-free. Descrive inoltre come preparare e misurare il campione, assemblare la configurazione richiesta e analizzare i dati per ottenere informazioni sull'organizzazione locale delle fibrille amiloidi.

Abstract

Rispetto alla sua controparte a un fotone, l'eccitazione a due fotoni è vantaggiosa per gli esperimenti di bioimaging a causa della sua minore fototossicità, della penetrazione più profonda nei tessuti, del funzionamento efficiente in sistemi densamente impacchettati e della ridotta fotoselezione angolare dei fluorofori. Pertanto, l'introduzione dell'analisi di polarizzazione nella microscopia a fluorescenza a due fotoni (2PFM) fornisce una determinazione più precisa dell'organizzazione molecolare in un campione rispetto ai metodi di imaging standard basati su processi ottici lineari. In questo lavoro, ci concentriamo sulla 2PFM sensibile alla polarizzazione (ps-2PFM) e sulla sua applicazione nella determinazione dell'ordinamento molecolare all'interno di biostrutture complesse-sferuliti amiloidi. Le malattie neurodegenerative come l'Alzheimer o il Parkinson sono spesso diagnosticate attraverso il rilevamento di aggregati amiloidi-proteici formatisi a causa di un alterato processo di misfolding proteico. L'esplorazione della loro struttura porta a una migliore comprensione del loro percorso di creazione e, di conseguenza, allo sviluppo di metodi diagnostici più sensibili. Questo articolo presenta il ps-2PFM adattato per la determinazione dell'ordinamento locale delle fibrille all'interno delle sferuliti di insulina bovina e degli aggregati proteici amiloidogenici sferici. Inoltre, dimostriamo che la tecnica proposta può risolvere l'organizzazione tridimensionale delle fibrille all'interno della sferulite.

Introduzione

Negli ultimi decenni, sebbene vi sia stato uno sviluppo significativo di numerose tecniche di microscopia a fluorescenza per il bioimaging delle proteine e dei loro aggregati1, solo alcune sono state utilizzate per risolvere il loro ordinamento locale all'interno del campione 2,3. Lamicroscopia a fluorescenza 4 è stata utilizzata per studiare l'eterogeneità strutturale intrinseca delle sovrastrutture-sferuliti amiloidi. Inoltre, la determinazione quantitativa dell'ordinamento locale all'interno di biostrutture complesse e densamente impacchettate come le sferulit....

Protocollo

1. Preparazione dei vetrini del microscopio con sferuliti completamente cresciute

NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, i reagenti e le apparecchiature utilizzati in questo protocollo. Tutte le soluzioni sono state preparate con acqua deionizzata (18,2 MΩ·cm a 25 °C) ottenuta dal sistema di purificazione dell'acqua.

  1. Incubare le sferuliti amiloidi in base al protocollo descritto da Krebs et al16. con alcune modifiche, come descritto di seguito.
    1. Pesare 10 mg di insulina in polvere in una provetta da 1,5 ml.
    2. Sciog....

Risultati Rappresentativi

Il protocollo presentato fornisce una guida passo dopo passo attraverso la preparazione delle sovrastrutture amiloidi per il test con ps-2PFM, la costruzione del sistema microscopico e le misurazioni del campione appropriato. Tuttavia, prima della serie finale di misurazioni, è fondamentale allineare correttamente gli APD con un riferimento isotropo, che dovrebbe portare alla raccolta di un segnale simmetrico di forma e intensità simili su entrambi i rivelatori (Figura 4C). Anche le differ.......

Discussione

La microscopia a due fotoni sensibile alla polarizzazione è uno strumento prezioso per studiare l'ordinamento locale delle fibrille all'interno delle sovrastrutture amiloidi, richiedendo solo piccole modifiche alla configurazione multifotone standard. Poiché opera su fenomeni ottici non lineari, è possibile ottenere una ridotta fotoselezione angolare e una maggiore risoluzione assiale rispetto ai metodi di microscopia a fluorescenza eccitata con un fotone. Inoltre, porta a una minore dispersione della luce, a una mino.......

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto Sonata Bis 9 (2019/34/E/ST5/00276) finanziato dal National Science Centre in Polonia.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mmChemland04-298.202.04
DPX mountant for histologySigma-Aldrich6522Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropyleneChemland02-63102
Eppendorf ThermoMixer CEppendorfUsed for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification systemHydrolabSource of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10),Sigma-Aldrich30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC))Sigma-AldrichI5500
Methanol (HPLC grade)Sigma-Aldrich270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mmChemland04-296.202.09
Olympus BX60OlympusPolarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2ChemlandVIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra IICoherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass FilterThorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass FilterThorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nmThorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NANikon
piezo 3D stagePiezosystem Jena
Polarizing BeamsplitterThorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mWThorlabs
Software
LabView 2018National InstrumentsVersion 18.0.1f2
Matplotlib libraryVersion 3.3.2
NumPy libraryVersion 1.19.2
SciPy libraryVersion 1.5.2
Spyder Python 3 IDEVersion 4.1.5

Riferimenti

  1. Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S., Giraldo, J., Ciruela, F. . Progress in Molecular Biology and Translational Science. 169, 1-41 (2020).
  2. Kress, A., et al. Probing orientational behavior of MHC class I protein a....

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