Generazione di organoidi renali in sospensione da cellule staminali pluripotenti indotte

Riepilogo

Questo protocollo presenta un metodo completo ed efficiente per la produzione di organoidi renali da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) utilizzando condizioni di coltura in sospensione. L'enfasi principale di questo studio risiede nella determinazione della densità cellulare iniziale e della concentrazione dell'agonista WNT, avvantaggiando così i ricercatori interessati alla ricerca sugli organoidi renali.

Abstract

Gli organoidi renali possono essere generati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) attraverso vari approcci. Questi organoidi sono molto promettenti per la modellazione delle malattie, lo screening dei farmaci e le potenziali applicazioni terapeutiche. Questo articolo presenta una procedura passo-passo per creare organoidi renali da iPSC, a partire dalla striscia primitiva posteriore (PS) fino al mesoderma intermedio (IM). L'approccio si basa sul terreno APEL 2, che è un mezzo definito, privo di componenti animali. È integrato con un'alta concentrazione di agonista WNT (CHIR99021) per una durata di 4 giorni, seguita da fattore di crescita dei fibroblasti 9 (FGF9)/eparina e una bassa concentrazione di CHIR99021 per altri 3 giorni. Durante questo processo, viene data enfasi alla selezione della densità cellulare ottimale e della concentrazione di CHIR99021 all'inizio delle iPSC, poiché questi fattori sono fondamentali per il successo della generazione di organoidi renali. Un aspetto importante di questo protocollo è la coltura in sospensione in una placca a bassa aderenza, che consente all'IM di svilupparsi gradualmente in strutture nefroniche, comprendenti strutture tubulari glomerulari, tubolari prossimali e distali, tutte presentate in un formato visivamente comprensibile. Nel complesso, questo protocollo dettagliato offre una tecnica efficiente e specifica per produrre organoidi renali da diverse iPSC, garantendo risultati positivi e coerenti.

Introduzione

Il rene svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi fisiologica, a seconda della sua unità funzionale. I nefroni, che espellono i prodotti di scarto, possono regolare la composizione dei fluidi corporei. La malattia renale cronica (CKD), causata da mutazioni ereditarie o da altri fattori ad alto rischio, progredisce fino alla malattia renale allo stadio terminale (ESKD)^1,2. L'ESKD è apparentemente dovuta alla limitata capacità di rigenerazione dei nefroni. Pertanto, è necessaria una terapia sostitutiva renale. La differenziazione diretta delle iPSC umane consente la generazione in vitro

Protocollo

Le iPSC utilizzate per il presente studio sono state ottenute da una fonte commerciale. Le cellule sono state mantenute con terreno mTeSR su piastre rivestite a matrice di membrana basale disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali). La Tabella 1 contiene tutte le composizioni dei mezzi utilizzati nello studio.

1. Placcatura di iPSC per la differenziazione e l'induzione di striature primitive posteriori (PS)

1. Lavare le iPSC sulla piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana con 2 mL di DPBS. Aspirare il DPBS con una pipetta.
2. Aggiungere 1 mL della soluzi....

Discussione

È stato descritto un protocollo dettagliato per la generazione di organoidi renali da iPSC, che comporta piccole modifiche al mezzo basale, alla densità cellulare iniziale e alla concentrazione di CHIR99021. In vari esperimenti, i fattori critici per il successo della generazione di organoidi renali sono risultati essere la differenziazione iniziale del mesoderma intermedio (IM) e lo stato cellulare il giorno 7. Inoltre, diverse linee di iPSC hanno mostrato variazioni nella proliferazione cellulare e nel potenziale di .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom	NEST	Cat #701003
Accutase	STEMCELL Technologies	Cat #o7920
Antibodies
Benzyl alcohol	Sigma-Aldrich	Cat #100-51-6
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	Cat #120-51-4
Biological Safety Cabinet	Haier	Cat #HR40  A2
Biotin anti-human LTL (1:300)	Vector Laboratories	Cat #B-1325
Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female)	N/A	N/A
Carbon dioxide level shaker	HAMANY	Cat #C0-06UC6
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
CHIR99021 (Wnt pathway activator)	STEMCELL Technologies	Cat #72054
Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate	Corning	Cat #3516
Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Corning	Cat #3471
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	Cat #07930
DAPI stain Solution	Coolaber	Cat #SL7102
Dextran, Alexa Fluor 647	Thermo SCIENTIFIC	Cat #D22914
DMEM/F-12 HEPES-free	Servicebio	Cat #G4610
Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	Cat #ab150179
Donkey serum stoste	Meilunbio	Cat #MB4516-1
D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red)	Solarbio Life Science	Cat #D1040
Dry Bath Incubator	Shanghai Jingxin	Cat #JX-10
Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032210
Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032220
Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032310
Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032320
Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032620
Experimental models: Cell Lines
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator	Thermo SCIENTIFIC	Cat #370
Geltre LDEV-Free	Gibco	Cat #A1413202
Glass Bottom Culture Dishes	NEST	Cat #801002
Goat anti-human CUBN (1:300)	Santa Cruz Biotechnology	Cat #sc-20607
Heparin Solution (Cell culture supplement)	STEMCELL Technologies	Cat #07980
Human Recombinant FGF-9	STEMCELL Technologies	Cat #78161
Inverted Microscope	OLYMPUS	Cat #CKX53
Laser Scanning Confocal Microscope	OLYMPUS	Cat #FV3000
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	Cat #M7027
Micro Centrifuge	HENGNUO	Cat #2-4B
Mouse anti-human CD31 (1:300)	BD Biosciences	Cat #555444
Mouse anti-human ECAD (1:300)	BD Biosciences	Cat #610182
Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300)	Abcam	Cat #ab30394
Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300)	Thermo SCIENTIFIC	Cat #39795
Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88)	Sigma-Aldrich	Cat #81381
mTeSR1 5X Supplement	STEMCELL Technologies	Cat #85852
mTeSR1 Basal Medium	STEMCELL Technologies	Cat #85851
Nunc CryoTube Vials	Thermo SCIENTIFIC	Cat #377267
Others
Rabbit anti-human GATA3 (1:300)	Cell Signaling Technology	Cat #5852S
Rabbit anti-human LRP2 (1:300)	Sapphire Bioscience	Cat #NBP2-39033
Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300)	Abcam	Cat #ab224491
Rabbit anti-human WT1 (1:300)	Abcam	Cat #ab89901
Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300)	Abcam	Cat #ab32570
Recombinant Human Serum Albumin (rHSA)	YEASEN	Cat #20901ES03
Sheep anti-human NPHS1 (1:300)	R&D Systems	Cat #AF4269
STEMdiff APEL 2 Medium	STEMCELL Technologies	Cat #05275
Streptavidin Cy3 (1:400)	Gene Tex	Cat #GTX85902
Versene (1X)	Gibco	Cat #15040066
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	Cat #72304