Espianto di membrane a finestra rotonda di porcellini d'India per studi ex vivo

Riepilogo

Questo protocollo delinea un metodo per l'espianto della membrana della finestra rotonda dalle ossa temporali dei porcellini d'India, fornendo una risorsa preziosa per gli studi ex vivo .

Abstract

La somministrazione efficiente e minimamente invasiva dei farmaci all'orecchio interno è una sfida significativa. La membrana a finestra rotonda (RWM), essendo uno dei pochi punti di ingresso all'orecchio interno, è diventata un punto focale di indagine. Tuttavia, a causa della complessità dell'isolamento dell'RWM, la nostra comprensione della sua farmacocinetica rimane limitata. L'RWM comprende tre strati distinti: l'epitelio esterno, lo strato intermedio di tessuto connettivo e lo strato epiteliale interno, ciascuno dei quali possiede proprietà di rilascio uniche.

Gli attuali modelli per studiare il trasporto attraverso l'RWM utilizzano modelli animali in vivo o modelli RWM ex vivo che si basano su colture cellulari o frammenti di membrana. I porcellini d'India fungono da modello preclinico validato per lo studio della farmacocinetica dei farmaci all'interno dell'orecchio interno e sono un importante modello animale per lo sviluppo traslazionale di veicoli di somministrazione alla coclea. In questo studio, descriviamo un approccio per l'espianto di un RWM di cavia con osso cocleare circostante per esperimenti di somministrazione di farmaci da banco. Questo metodo consente di preservare l'architettura RWM nativa e può fornire una rappresentazione più realistica delle barriere al trasporto rispetto agli attuali modelli da banco.

Introduzione

Sono emerse nuove classi di terapie per il trattamento dell'ipoacusia neurosensoriale. La traduzione di queste terapie nelle popolazioni cliniche è limitata da vie di trasporto sicure ed efficaci nell'orecchio interno. Gli attuali metodi di somministrazione in vivo negli studi sugli animali si basano sulla fenestrazione nell'orecchio interno o sulla diffusione attraverso la membrana a finestra rotonda (RWM), una barriera non ossea che separa lo spazio dell'orecchio medio dalla coclea¹.

La fenestrazione chirurgica e la microiniezione nell'orecchio interno sono entrambe invasive e possono comportare rischi per la funzione residua dell'orecchio interno². Pertanto, l'RWM è una via importante per la somministrazione locale di farmaci e le cavie sono il principale modello animale preclinico utilizzato per studiare la farmacocinetica dei farmaci locali attraverso l'RWM e nell'orecchio interno per lo sviluppo farmaceutico ^3,4. Sebbene più sottile dell'RWM umano, il porcellino d'India RWM condivide un'identica struttura a tre strati. Ha un diametro di circa 1 mm, uno spessore di 15-25 μm ed è composto da due strati di cellule epiteliali che racchiudono uno strato di tessuto connettivo⁵. Lo strato epiteliale rivolto verso l'orecchio medio è densamente impacchettato e collegato tramite giunzioni strette, mentre lo strato rivolto verso l'orecchio interno e la scala timpanica ha un'architettura più sciolta e non ha aderenze intercellulari significative.

Gli attuali studi preclinici che indagano la permeabilità ai farmaci nella RWM cavia si basano su iniezioni in vivo nell'orecchio medio seguite dal campionamento del liquido perilinfatico all'interno dell'orecchio interno, il che non consente lo studio specifico del trasporto RWM ^6,7. Frammenti di espianti RWM sono stati utilizzati in studi preclinici, ma a causa della loro fragilità e delle loro piccole dimensioni, non sono adatti per indagini microfluidiche sistematiche sul trasporto di farmaci e veicoli che richiedono una tenuta stagna attraverso l'RWM². Altri gruppi hanno impiegato modelli in vitro con cellule epiteliali umane in coltura per approssimare l'RWM ^8,9,10. Tuttavia, la maggior parte di questi costrutti si concentra esclusivamente sullo strato epiteliale esterno e non cattura la complessità dell'architettura del tessuto nativo. Per una comprensione più dettagliata dei meccanismi di trasporto attraverso l'RWM, sono necessari studi mirati ex vivo.

In questo studio, dimostriamo l'espianto di un RWM di cavia con supporto osseo circostante per preservare l'integrità della membrana e illustriamo il loro utilizzo in un paradigma sperimentale progettato per lo studio specifico del trasporto RWM di veicoli per la somministrazione di farmaci.

Protocollo

Tutte le procedure per la cura e l'uso degli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (GP18M226). Nel presente studio sono stati utilizzati porcellini d'india albini Hartley (sia maschi che femmine, del peso di 500-700 g).

1. Impostazione e preparazione della procedura

1. Sterilizzare tutti gli strumenti con ossido di etilene prima di iniziare l'esperimento.
2. Sopprimere gli animali seguendo il protocollo istituzionalmente approvato.
   NOTA: Nel presente studio, è stata impiegata una camera non precaricata per rilasciare il 100% di anidride carbonica (CO₂ ) da una bombola commerciale. Un limitatore in linea è stato utilizzato per regolare il flusso di gas, mantenendolo nell'intervallo compreso tra il 30% e il 70% del volume al minuto della camera in conformità con le linee guida AVMA 2020¹¹.
3. Posizionare l'animale nella camera ed erogare anidride carbonica per 5 minuti. Il flusso di CO₂ viene mantenuto per 1 minuto dopo l'arresto respiratorio.
4. Eseguire la decapitazione dopo l'arresto respiratorio per garantire l'eutanasia.

2. Approccio chirurgico ed espianto

1. Estrarre l'osso temporale dal cranio del porcellino d'India nel modo consueto¹². Rimuovere i tessuti molli in eccesso con un rongeur. Identificare il meato acustico esterno, la bolla temporale e il canale facciale¹³ (Figura 1).
2. Forare gli aspetti ventrali della bolla temporale con una punta diamantata da 6 mm (vedi Tabella dei materiali), esponendo circonferenzialmente lo spazio dell'orecchio medio e il condotto uditivo esterno.
3. Utilizzando i rongeur, rimuovere delicatamente il condotto uditivo esterno e l'anello timpanico, separando contemporaneamente l'articolazione incudomalleolare. Identificare l'incudine, l'articolazione incudostapediale, la coclea, il canale semicircolare orizzontale e il canale facciale¹³ (Figura 2A).
4. Separare l'articolazione incudostapediale e rimuovere l'incudine usando una pinza. Identifica la nicchia ossea della finestra rotonda.
5. Utilizzare una punta diamantata da 6 mm per perforare la lamina ossea che collega la coclea con la parete mediale della cavità timpanica verso il canale tensore del timpano. Decomprimere con cura il canale osseo del tensore del timpano e rimuovere il muscolo tensore del timpano utilizzando un ago da 28 G.
   NOTA: La parete mediale della fossa tensoriale del timpano si collega direttamente con l'osso cocleare intorno al RWM e si presta attenzione a non causare fratture che possono estendersi alla finestra rotonda.
6. Perforare la lamina ossea che collega la coclea alla parete inferiore della cavità timpanica fino a quando non rimane 1 mm di sporgenza ossea adiacente alla coclea (Figura 2B).
7. Utilizzando una punta diamantata da 2 mm (vedi Tabella dei materiali), eseguire una cocleostomia in corrispondenza del giro basale della coclea, lasciando circa 2 mm di osso alla finestra rotonda. Continuare la cocleostomia inferiormente su un piano parallelo alla membrana della finestra rotonda per separare la base dall'apice della coclea.
8. Estendere il taglio della cocleostomia attraverso la base del cranio, che è molto più densa, ottenendo una visione in sezione trasversale del giro basale della coclea.
   NOTA: Puntando il trapano verso il meato del condotto uditivo interno si ottiene una traiettoria che massimizza la rimozione dell'osso evitando di avvicinarsi troppo alla finestra rotonda.
9. Esaminare il campione dal lato della base del cranio e, se non è già stato fatto, identificare il condotto uditivo interno e perforare l'apertura cocleare. Rimuovere il nervo cocleare con un ago da 28 G.
10. Esaminare il campione dal lato intracocleare. Identificare e rimuovere la lamina spirale ossea nel giro basale e il modiolo rimanente con una pinza o un ago da 28 G.
11. Irrigare copiosamente la cavità unificata dei vestiboli scala-scala per rimuovere i detriti. La finestra rotonda deve essere chiaramente visibile dalla cochectomia senza detriti sovrastanti (Figura 2C).
12. Quindi, esamina il campione dal lato dell'orecchio medio. Forare il canale semicircolare laterale e il canale facciale fino al livello della finestra ovale. Rimuovere delicatamente le staffe usando una pinza, esponendo la nicchia ovale della finestra. Da notare che c'è un ponte osseo tra la crura delle staffe noto come crista stapedis.
13. Utilizzando un trapano diamantato da 1 mm (vedi Tabella dei materiali), aprire ulteriormente il vestibolo estendendo la finestra ovale lungo la faccia della finestra rotonda, avendo cura di mantenere 1-2 mm di osso cocleare adiacente alla nicchia rotonda della finestra (Figura 2D).
14. Completa i tagli dell'osso temporale collegando i tagli della finestra ovale con i tagli della coclectomia su ciascun lato della finestra rotonda.
    NOTA: A causa della fragilità dell'osso cocleare, preservare la fossa tensoriale del timpano nel campione ed evitare tagli attraverso di essa aiuterà a prevenire le fratture dell'osso cocleare che si estendono all'RWM e ne compromettono l'integrità.
15. Effettuare gli attacchi finali all'osso denso della base cranica adiacente al condotto uditivo interno e radere delicatamente per ottenere un campione RWM asportato (Figura 3A).

Risultati

Come dimostrato nella Figura 3A, questo metodo consente l'espianto della membrana a finestra rotonda intatta del porcellino d'India con un anello circostante di osso rigido. L'RWM deve essere completamente collegato all'anulus osseo circonferenzialmente. Non devono essere apprezzate fratture dell'osso cocleare. Rispetto agli esemplari umani a finestra rotonda, il porcellino d'India RWM non ha una pseudomembrana sovrastante. Inoltre, a differenza degli esseri umani, c'è un ponte osseo tra la...

Discussione

Nella somministrazione locale di farmaci all'orecchio, l'RWM è la principale via di passaggio per le terapie per raggiungere l'orecchio interno. È necessario un modello da banco accurato e affidabile per comprendere meglio i meccanismi di trasporto e la permeabilità attraverso i nuovi veicoli di somministrazione e per lo sviluppo di farmaci. In questo studio, dimostriamo che l'espianto di RWM da cavia è una procedura fattibile e affidabile per consentire indagini sistematiche sulle interazioni farmaco-membrana. Lundm...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	1SD-G1
2 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	2SD-G1
6 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	6D-G1
ANSPACH EMAX 2 Plus System	Anspach	EMAX2PLUS	Any bone cutting drilling system will work
BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe	Becton, Dickinson, and Co.	382903057894	Any 27-28 G needle
Gorilla Epoxy	Gorilla	4200101
Kwik-CAST	World Precision Instruments	KWIK-CAST