Un modello di ratto di acne composta

Riepilogo

Questo protocollo delinea la procedura per indurre l'infiammazione dell'acne nella pelle di ratto con acido oleico e Cutibacterium acnes.

Abstract

L'acne vulgaris è una condizione cronica della pelle prevalente caratterizzata dalla presenza di comedoni, papule e pustole su viso, collo e petto. Per simulare l'infiammazione dell'acne vulgaris, questo protocollo descrive in dettaglio un approccio per stabilire un modello di roditore composto da acne inducendo l'infiammazione dell'acne nelle orecchie di ratto utilizzando acido oleico e Cutibacterium acnes (C. acnes). I ratti sono stati divisi casualmente in quattro gruppi: il gruppo di controllo normale (NC), le orecchie trattate con il gruppo dell'acido oleico (OA), le orecchie trattate con il gruppo C. acnes (C. acnes), le orecchie trattate con acido oleico e C. acnes (OA + C. acnes). Per imitare l'eccessiva produzione di sebo, l'acido oleico è stato spalmato sulle orecchie dei ratti nei gruppi OA e OA + C. acnes per 25 giorni.

Dal giorno 21 al 25, la sospensione di C. acnes è stata iniettata per via intradermica nelle orecchie dei ratti nei gruppi C. acnes e OA + C. acnes per aggravare l'infiammazione dell'acne. Lo spessore dell'orecchio è stato misurato settimanalmente come indicatore della gravità dell'infiammazione. Sono stati condotti l'osservazione macroscopica, la colorazione con ematossilina ed eosina e l'immunoistochimica (IHC) e i risultati hanno mostrato che le orecchie del gruppo OA + C. acnes erano ispessite e indurite, accompagnate da eritema e presenza di comedoni. Inoltre, le papule sono state osservate nei gruppi C. acnes e OA + C. acnes . L'istopatologia mostrava ipercheratinizzazione e infundibolo espanso dei follicoli piliferi nei gruppi OA e OA + C. acnes . Infiltrazioni di cellule infiammatorie e ascessi sono stati trovati nel derma dei gruppi C. acnes e OA + C. acnes . I risultati dell'IHC hanno confermato un aumento dei livelli di fattore di necrosi tumorale (TNF)-α nel derma dei gruppi C. acnes e OA + C. acnes . Tutti i risultati di cui sopra hanno indicato collettivamente il successo dell'istituzione del modello di roditore dell'acne composta.

Introduzione

L'acne vulgaris è una comune malattia cronica della pelle caratterizzata dalla presenza di comedoni, papule e pustole su viso, collo e torace, che, nei casi più gravi, possono progredire in noduli, cisti e cicatrici permanenti¹. Studi epidemiologici riportano che l'acne colpisce il 9,4% della popolazione globale, mentre i sintomi che ne derivano pongono gravi sfide fisiche e psicosociali ^2,3.

La patogenesi dell'acne è multifattoriale e comprende quattro processi critici: l'eccessiva produzione di sebo, la formazione di comedoni, la colonizzazione follicolare da parte del microbiota cutaneo e il rilascio di mediatori infiammatori intorno all'unità pilosebacea ^4,5. L'aumento della secrezione di sebo, con conseguente accumulo di acidi grassi liberi insaturi (UFFA) in eccesso, contribuisce alla riproduzione anomala del microbiota cutaneo, uno dei quali è il Cutibacterium acnes, come dimostrato negli studi genomici⁶. Nel frattempo, il microbiota cutaneo decompone il sebo e aumenta la concentrazione di UFFA, portando a un circolo vizioso⁷. Inoltre, l'eccesso di UFFA causa ipercheratinizzazione nei follicoli piliferi, che a sua volta scatena l'acne⁸. Il microbiota cutaneo e l'aumento del sebo attivano entrambi i recettori Toll-like (TLR) per produrre più citochine proinfiammatorie come l'interleuchina (IL)-1 e il TNF-α ^9,10. Questa cascata di infiammazione, unita all'aumento del sebo e alla crescita eccessiva di microbi, culmina in una pronunciata ipercheratosi del follicolo pilifero e nell'insorgenza dell'acne¹¹.

Il rapido sviluppo nel campo della ricerca sull'acne e i relativi requisiti clinici hanno portato alla creazione di una serie di modelli animali di infiammazione dell'acne sull'orecchio di ratto, sul dorso di ratti o topi e sull'orecchio di coniglio 12,13,14,15. I metodi includono l'iniezione intradermica di C. acne, l'applicazione di oli sulla pelle per simulare la secrezione anomala delle ghiandole sebacee e l'ipercheratinizzazione, o una combinazione di entrambi per accelerare l'infiammazione della pelle per formare l'acne 16,17,18,19. Tuttavia, l'uso e il dosaggio di agenti chimici e agenti biologici variano tra gli studi precedenti, il che può confondere i ricercatori che intendono stabilire un modello di acne appropriato. Questo studio mirava a stabilire un metodo facile da usare ed efficace per formare un modello di roditore composto da acne e fornire un modello di riferimento per i ricercatori che studiano l'acne vulgaris.

Protocollo

Questo protocollo ha ricevuto l'approvazione etica dall'Università di Medicina Cinese di Pechino (n. 2023033103-1183). In questo protocollo sono stati utilizzati dodici ratti maschi di Sprague-Dawley (peso, 208 g ± 5 g) e divisi in quattro gruppi: gruppo NC (n = 3), gruppo OA (n = 3), gruppo C. acnes (n = 3) e gruppo OA + C. acnes (n = 3).

1. Sviluppo del modello dell'acne

1. Misurare e registrare lo spessore delle orecchie di ratto utilizzando un calibro elettronico a corsoio (vedi Tabella dei materiali) prima della modellazione.
   1. Posizionare la ganascia esterna del calibro elettronico a corsoio nel punto medio del bordo esterno dell'orecchio ed estenderla nel condotto uditivo. Registrare lo spessore di 2/3 punti e lo spessore di 1/2 punti lungo la linea. Misurare ogni punto 3 volte e calcolare i valori medi dello spessore di due punti da considerare lo spessore dell'orecchio.
2. Inclinare la testa del ratto da un lato, fare l'orecchio rivolto verso l'alto e applicare 50 μL di acido oleico (vedi Tabella dei materiali) sui lati ventrale e dorsale dell'orecchio in modo uniforme, una volta al giorno, per 25 giorni.
3. Dal giorno 21 al giorno 25, ogni giorno prima dell'applicazione dell'acido oleico, anestetizzare i ratti utilizzando isoflurano al 4% e quindi iniettare 50 μL di sospensione di C. acnes 1 ×^{10 7} CFU (vedere Tabella dei materiali) per via intradermica nella superficie ventrale dell'orecchio utilizzando una siringa da 1 ml dotata di un ago da 34 G o 36 G (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: Fare attenzione a evitare i vasi sanguigni nell'orecchio durante l'iniezione per via intradermica. È necessaria una micro-siringa con ago da 34 G o 36 G (vedi Tabella dei materiali). Per garantire una corretta iniezione intradermica, l'ago deve essere perforato con un angolo compreso tra 10 e 15 gradi, con una profondità di circa 1 mm.
4. Il giorno 25, misurare e registrare lo spessore delle orecchie, come descritto al punto 1.1.
   NOTA: Il gruppo OA è stato spalmato solo con acido oleico come descritto al punto 1.2 e iniettato con soluzione fisiologica dal 21° al 25° giorno. Il gruppo C. acnes è stato iniettato solo per via intradermica mediante sospensione di C. acnes , come descritto al punto 1.3. Il gruppo OA + C. acnes è stato trattato con acido oleico e sospensione di C. acnes , come descritto nei passaggi 1.2 e 1.3.

2. Raccolta e analisi dei tessuti

1. Il giorno 26, dopo che i ratti sono stati sottoposti a eutanasia umana utilizzando un metodo approvato istituzionalmente, perforare le orecchie bilaterali a dimensione fissa con un trapano ad anello da 8 mm.
2. Immergere i tessuti dell'orecchio in paraformaldeide al 4% per 24 ore, quindi incorporare la paraffina e sezionare in fette di 5 μm di spessore per la colorazione con ematossilina ed eosina (HE)²⁰. Osservare le sezioni al microscopio ottico e registrare i cambiamenti patologici per la valutazione di follow-up da parte di un patologo. Assegnare punteggi alle alterazioni patologiche secondo la Tabella 1 (vedi anche Figura 1).
3. Deparaffinizzare, reidratare e riscaldare le sezioni per il recupero dell'antigene. Inattivare le perossidasi endogene incubando con 0,3% di H₂O₂ in metanolo per 15 minuti a temperatura ambiente.
4. Lavare le sezioni con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e poi incubarle con BSA al 3% per 30 minuti a temperatura ambiente.
5. Incubare le sezioni con anticorpo monoclonale TNF-α (diluizione 1:800) (vedi Tabella dei materiali) a 4 °C per una notte.
6. Lavare nuovamente le sezioni con PBS e incubare con anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (vedere Tabella dei materiali) per 50 minuti.
7. Dopo un altro lavaggio con PBS, applicare la miscela di 3,3'-diaminobenzidina (DAB) sui vetrini e monitorare il processo di colorazione al microscopio, interrompendo la reazione con PBS quando viene raggiunta l'intensità desiderata.
8. Controcolorare le sezioni con l'ematossilina di Meyer per 1 minuto, sciacquarle con acqua corrente, disidratarle e montare le sezioni. Osservare le sezioni al microscopio e registrare i cambiamenti patologici per la valutazione di follow-up da parte di un patologo.

3. Analisi statistica

1. Eseguire analisi statistiche.
2. Presenta i dati come media ± deviazione standard. Accedi alla normalità di tutti i dati utilizzando il test di Shapro-Wilke. Se segue una distribuzione normale, utilizzare l'ANOVA unidirezionale per valutare le differenze significative. Per i dati non distribuiti normalmente, applicare il test di Kruskal-Wallis seguito dai confronti multipli di Dunn. Un valore p inferiore a 0,05 è considerato statisticamente significativo.

Risultati

Spessore e aspetto della pelle
Dal giorno 7 al giorno 21, le orecchie del gruppo OA e del gruppo OA + C. acnes erano significativamente più spesse di quelle dei gruppi NC e C. acnes . Il giorno 25, le orecchie del gruppo OA, del gruppo C. acnes e del gruppo OA + C. acnes erano significativamente più spesse di quelle del gruppo NC (p < 0,05). Lo spessore medio delle orecchie durante l'esperimento è mostrato nella

Discussione

Poiché la metodologia e i criteri di valutazione per un modello di acne non erano chiari, questo protocollo mirava a fornire un riferimento per i ricercatori che studiano l'acne. A causa delle piccole dimensioni dell'orecchio del topo e dell'interferenza causata dalla crescita dei peli sul dorso, dall'uso di crema depilatoria e di un rasoio, l'orecchio del ratto può essere un'alternativa migliore per stabilire un modello di acne da roditore. Avevamo tentato di creare il modello dell'ac...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaero-indicator	Mitsubishi, Japan	C-22
AnaeroPack	Mitsubishi, Japan	C-11, C-41
Columbia blood agar plate	BeNa Cuture Collection, China	BNCC330605
Constant temperature incubator	SHANGCHENG, China	303-0
Cotton swab	HYNAUT, China	_
Cutibacterium acnes	BeNa Cuture Collection, China	BNCC330605
Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse	DAKO, Denmark	K5007
disposable sterile injection needle	Zhejiang Oujian Medical Apparatus, China	_
Electronic scale	JINXUAN, China	A017
Electronic vernier caliper	Deli, China	DL90150
Oleic acid (Analytical reagent, AR)	Fangzheng, China	_
Sodium chloride injection	CR Double CRANE, China	Y2212241
SPSS Statistics	IBM, USA	26.0
sterile hypodermic syringes	Shandong weigao group medical polymer, China	_
TNF Alpha Monoclonal antibody	Proteintech Group,int, USA	60291-1-lg