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Registrazione dell'integrità funzionale della barriera su cellule endoteliali vascolari bEnd.3 tramite rilevamento della resistenza elettrica transendoteliale
In questo articolo
Riepilogo
Questo protocollo descrive un modello in vitro affidabile ed efficiente della barriera emato-encefalica. Il metodo utilizza cellule endoteliali vascolari cerebrali di topo bEnd.3 e misura la resistenza elettrica transmembrana.
Abstract
La barriera emato-encefalica (BBB) è una struttura fisiologica dinamica composta da cellule endoteliali microvascolari, astrociti e periciti. Coordinando l'interazione tra il transito limitato di sostanze nocive, l'assorbimento dei nutrienti e la clearance dei metaboliti nel cervello, la BBB è essenziale per preservare l'omeostasi del sistema nervoso centrale. La costruzione di modelli in vitro della BBB è uno strumento prezioso per esplorare la fisiopatologia dei disturbi neurologici e creare trattamenti farmacologici. Questo studio descrive una procedura per la creazione di un modello di cellula BBB monostrato in vitro seminando cellule bEnd.3 nella camera superiore di una piastra a 24 pozzetti. Per valutare l'integrità della funzione di barriera cellulare, il voltmetro convenzionale a cellule epiteliali è stato utilizzato per registrare in tempo reale la resistenza elettrica transmembrana delle cellule normali e delle cellule ipossiche indotte da CoCl2. Prevediamo che gli esperimenti di cui sopra forniranno spunti efficaci per la creazione di modelli in vitro di BBB e farmaci per il trattamento dei disturbi delle malattie del sistema nervoso centrale.
Introduzione
La BBB è un'interfaccia biologica unica tra la circolazione sanguigna e il tessuto nervoso, composto da cellule endoteliali vascolari, periciti, astrociti, neuroni e altre strutture cellulari1. Il flusso di ioni, sostanze chimiche e cellule tra il sangue e il cervello è strettamente regolato da questa barriera. Questa omeostasi protegge i tessuti nervosi dalle tossine e dagli agenti patogeni, consentendo anche il corretto funzionamento dei nervi cerebrali 2,3. Mantenere l'integrità della BBB può prevenire efficacemente lo sviluppo e la progressione di disturbi che colpiscono il sistema ....
Protocollo
NOTA: Le cellule endoteliali derivate dal cervello di topo.3 (bEnd.3) sono state inoculate nelle camere di una piastra a 24 pozzetti per costruire un semplice modello in vitro di BBB in condizioni specifiche del terreno. Il TEER delle cellule normali e delle cellule ipossiche è stato misurato con il misuratore TEER (Figura 1 e Figura 2).
1. Preparazione della soluzione
- Preparare il terreno di coltura cellulare DMEM contenente FBS (10%, v/v), 100 U/mL di penicillina e 10 mg/mL di streptomicina (vedere la tabella dei materiali).
Risultati Rappresentativi
Questo protocollo ha permesso di registrare le variazioni dei valori di resistenza delle cellule in base ai parametri impostati nel resistore transendoteliale. La vitalità delle cellule bEnd.3 (numero di cellule vive) trattate con diverse concentrazioni di CoCl2 è stata esaminata mediante test CCK-8. Il maggior danno cellulare prodotto da CoCl2 è stato rappresentato da una minore vitalità cellulare. Abbiamo scoperto che 300 μM di CoCl2 erano significativamente citotossici in vitr.......
Discussione
Uno degli organi corporei più sviluppati, il cervello controlla un'ampia gamma di intricati processi fisiologici, tra cui la memoria, la cognizione, l'udito, l'olfattoe il movimento. Il cervello è uno degli organi più complicati e malati del corpo umano allo stesso tempo. L'insorgenza di molti disturbi del sistema nervoso centrale mostra una tendenza crescente anno dopo anno a causa di fattori quali l'inquinamento atmosferico, i modelli alimentari irregolari e altri fattori 27,28,29.
Divulgazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Riconoscimenti
Apprezziamo il sostegno finanziario della National Natural Science Foundation of China (82274207 e 82104533), del Key Research and Development Program di Ningxia (2023BEG02012) e dello Xinglin Scholar Research Promotion Project dell'Università di Chengdu di MTC (XKTD2022013).
....Materiali
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) | |
| Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |
Riferimenti
- Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48 (2020).
- Bagchi, S., et al.
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