Cattura dell'agitazione basata sul citoscheletro del nucleo dell'ovocita di topo su scale spaziali

Riepilogo

Questo protocollo fornisce un quadro sperimentale per documentare l'impatto fisico del citoscheletro sulla forma nucleare e sugli organelli interni privi di membrana nel sistema ovocitario di topo. Il framework può essere adattato per l'uso in altri tipi di cellule e contesti.

Abstract

Una delle principali sfide nella comprensione delle cause dell'infertilità femminile è quella di chiarire i meccanismi che regolano lo sviluppo delle cellule germinali femminili, chiamate ovociti. Il loro sviluppo è caratterizzato dalla crescita cellulare e dalle successive divisioni, due fasi critiche che preparano l'ovocita alla fusione con gli spermatozoi per avviare l'embriogenesi. Durante la crescita, gli ovociti riorganizzano il loro citoplasma per posizionare il nucleo al centro della cellula, un evento predittivo del successo dello sviluppo degli ovociti nei topi e nell'uomo e, quindi, del loro potenziale embriogenico. Negli ovociti di topo, è stato dimostrato che questa riorganizzazione citoplasmatica è guidata dal citoscheletro, la cui attività genera forze meccaniche che agitano, si riposizionano e penetrano nel nucleo. Di conseguenza, questa trasmissione di forza citoplasmatica-nucleoplasmatica sintonizza la dinamica degli organelli di elaborazione dell'RNA nucleare noti come condensati biomolecolari. Questo protocollo fornisce un quadro sperimentale per documentare, con un'elevata risoluzione temporale, l'impatto del citoscheletro sul nucleo su scale spaziali negli ovociti di topo. Descrive in dettaglio le fasi e gli strumenti di imaging e analisi delle immagini necessari per valutare i) l'attività del citoscheletro nel citoplasma dell'ovocita, ii) l'agitazione del nucleo dell'ovocita basata sul citoscheletro e iii) i suoi effetti sulla dinamica biomolecolare del condensato nel nucleoplasma dell'ovocita. Al di là della biologia degli ovociti, i metodi qui elaborati possono essere adattati per l'uso nelle cellule somatiche per affrontare in modo simile la sintonizzazione basata sul citoscheletro delle dinamiche nucleari su tutte le scale.

Introduzione

Il posizionamento nucleare è essenziale per molteplici funzioni cellulari e di sviluppo 1,2,3,4,5. Le cellule germinali femminili dei mammiferi chiamate ovociti rimodellano il loro citoplasma per posizionare il nucleo al centro della cellula nonostante subiscano una divisione asimmetrica delle dimensioni, che si basa sul successivo decentramento del cromosoma⁶ (Figura 1). Questa centratura del nucleo predice il successo dello sviluppo degli ovociti nei t....

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida della Comunità Europea e sono stati approvati dal Ministero dell'Agricoltura francese (autorizzazione n. 75-1170) e dalla Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; DUO 5291). I topi sono stati alloggiati nella struttura per animali con un ciclo luce/buio di 12 ore, con una temperatura ambiente di 22-24 °C e un'umidità del 40%-50%. I topi utilizzati includono la femmina OF1 (Oncins France 1, da 8 a 12 settimane) e la femmina C57BL/6 (da 10 a 14 settimane).

1. Raccolta e preparazione degli ovociti

1. Raccogliere ....

Discussione

I passaggi chiave di questo protocollo includono una corretta microiniezione di ovociti senza compromettere la loro sopravvivenza o la loro normale funzione ^9,10,11, nonché la microiniezione di quantità predefinite di cRNA che consentirebbero la corretta visualizzazione di strutture rilevanti, come le macchioline nucleari.

Stabilire il legame tra la dinamica citoplasmatica e quella (intra)nucleare ?.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 spinning disk	Yokogawa
DMI6000B microscope	Leica
Femtojet microinjector	Eppendorf
Fiji
Filter wheel	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph software	Universal Imaging,		version 7.7.9.0
Mineral oil	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
OF1 and C57BL/6 mice	Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3 CCD camera	QImaging
RNAeasy kit	Qiagen	74104
SC35 antibody	Abcam	ab11826	Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
Stripper Micropipette	XLAB Solutions		specialized for oocyte collection
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
Thermostatic chamber	Life Imaging Service
Windows Excel	Windows