Cattura dell'agitazione basata sul citoscheletro del nucleo dell'ovocita di topo su scale spaziali

Riepilogo

Questo protocollo fornisce un quadro sperimentale per documentare l'impatto fisico del citoscheletro sulla forma nucleare e sugli organelli interni privi di membrana nel sistema ovocitario di topo. Il framework può essere adattato per l'uso in altri tipi di cellule e contesti.

Abstract

Una delle principali sfide nella comprensione delle cause dell'infertilità femminile è quella di chiarire i meccanismi che regolano lo sviluppo delle cellule germinali femminili, chiamate ovociti. Il loro sviluppo è caratterizzato dalla crescita cellulare e dalle successive divisioni, due fasi critiche che preparano l'ovocita alla fusione con gli spermatozoi per avviare l'embriogenesi. Durante la crescita, gli ovociti riorganizzano il loro citoplasma per posizionare il nucleo al centro della cellula, un evento predittivo del successo dello sviluppo degli ovociti nei topi e nell'uomo e, quindi, del loro potenziale embriogenico. Negli ovociti di topo, è stato dimostrato che questa riorganizzazione citoplasmatica è guidata dal citoscheletro, la cui attività genera forze meccaniche che agitano, si riposizionano e penetrano nel nucleo. Di conseguenza, questa trasmissione di forza citoplasmatica-nucleoplasmatica sintonizza la dinamica degli organelli di elaborazione dell'RNA nucleare noti come condensati biomolecolari. Questo protocollo fornisce un quadro sperimentale per documentare, con un'elevata risoluzione temporale, l'impatto del citoscheletro sul nucleo su scale spaziali negli ovociti di topo. Descrive in dettaglio le fasi e gli strumenti di imaging e analisi delle immagini necessari per valutare i) l'attività del citoscheletro nel citoplasma dell'ovocita, ii) l'agitazione del nucleo dell'ovocita basata sul citoscheletro e iii) i suoi effetti sulla dinamica biomolecolare del condensato nel nucleoplasma dell'ovocita. Al di là della biologia degli ovociti, i metodi qui elaborati possono essere adattati per l'uso nelle cellule somatiche per affrontare in modo simile la sintonizzazione basata sul citoscheletro delle dinamiche nucleari su tutte le scale.

Introduzione

Il posizionamento nucleare è essenziale per molteplici funzioni cellulari e di sviluppo 1,2,3,4,5. Le cellule germinali femminili dei mammiferi chiamate ovociti rimodellano il loro citoplasma per posizionare il nucleo al centro della cellula nonostante subiscano una divisione asimmetrica delle dimensioni, che si basa sul successivo decentramento del cromosoma⁶ (Figura 1). Questa centratura del nucleo predice il successo dello sviluppo degli ovociti nei topi e nell'uomo ^7,8 e, quindi, il loro potenziale embriogenico (Figura 1).

Il rimodellamento citoplasmatico negli ovociti di topo è guidato principalmente dal citoscheletro dell'actomiosina⁹ (Figura 2). La sua attività genera forze meccaniche che agitano, si riposizionano e penetrano nel nucleo¹⁰ (Figura 2). Di conseguenza, questa trasmissione di forza citoplasmatica-nucleoplasmatica sintonizza la dinamica degli organelli di elaborazione dell'RNA messaggero nucleare chiamati macchioline nucleari¹¹, uno dei numerosi organelli senza membrana nel nucleo noti come condensati biomolecolari 12,13,14,15,16 (Figura 2).

L'imaging dal vivo è stato decisivo per decifrare le implicazioni funzionali dell'agitazione nucleare. I filmati della migrazione nucleare nel corso delle ore, così come i filmati ad alta risoluzione temporale della maglia di actina e del citoplasma di massa, hanno ampiamente contribuito all'elaborazione di un modello teorico per il posizionamento nucleare, collegando diverse scale temporali⁹. Inoltre, filmati ad alta risoluzione temporale del citoplasma, del profilo nucleare e dei componenti nucleari come la cromatina e i condensati nucleari, hanno evidenziato il ruolo dell'agitazione del nucleo basata sul citoscheletro sull'elaborazione dell'RNA e sull'espressione genica negli ovociti di topo, collegando diverse scale spazio-temporali all'interno della cellula^10,11. Nel complesso, un tale approccio di incrocio di scala basato sull'imaging dal vivo ha fornito il primo razionale che collega l'agitazione citoscheletrica del nucleo al successo dello sviluppo degli ovociti.

Il protocollo fornisce la pipeline di imaging e analisi delle immagini utilizzata per studiare la trasmissione delle forze citoplasmatiche (generate principalmente dalla F-actina e in parte dai microtubuli) al nucleo e ai suoi componenti interni negli ovociti di topo. Il risultato di questi esperimenti è quello di catturare il continuum delle forze su scale spaziali, dal citoscheletro nel citoplasma all'interno del nucleo attraverso filmati ad alta risoluzione temporale, come mostrato in due recenti studi ^10,11, che hanno stabilito il legame tra i movimenti attivi citoplasmatici, le fluttuazioni del contorno nucleare, così come il movimento e le fluttuazioni superficiali di un singolo tipo di condensati biomolecolari nucleari: macchioline nucleari. Lo stesso approccio può essere applicato ad altri sistemi modello in cui ci si aspetta che le forze citoplasmatiche cambino, come nel contesto delle cellule tumorali maligne¹⁷.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida della Comunità Europea e sono stati approvati dal Ministero dell'Agricoltura francese (autorizzazione n. 75-1170) e dalla Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; DUO 5291). I topi sono stati alloggiati nella struttura per animali con un ciclo luce/buio di 12 ore, con una temperatura ambiente di 22-24 °C e un'umidità del 40%-50%. I topi utilizzati includono la femmina OF1 (Oncins France 1, da 8 a 12 settimane) e la femmina C57BL/6 (da 10 a 14 settimane).

1. Raccolta e preparazione degli ovociti

1. Raccogliere ovociti da topi di età compresa tra 8 e 14 settimane come descritto in¹⁸ e¹⁹.
   1. In breve, per prima cosa estrarre le ovaie dai topi come in¹⁸ in terreno preriscaldato (37 °C) M2+Albumina sierica bovina (BSA) integrato con 1 μM di Milrinone¹⁹, che impedisce la ripresa della meiosi negli ovociti.
   2. Perforare i follicoli ovarici con aghi chirurgici per liberare gli ovociti in crescita dai follicoli antrali (fine della crescita degli ovociti²⁰).
   3. Raccogliere ovociti delle dimensioni necessarie per gli esperimenti (ovociti in crescita e/o completamente cresciuti) con una micropipetta specializzata per la raccolta degli ovociti, prima di lavarli e spostarli in piatti con terreno fresco sotto olio minerale.
2. Dissociare meccanicamente gli ovociti dalle cellule follicolari antrali pipettando su e giù e lasciare stabilizzare per 1 ora nell'incubatrice a 37 °C prima di procedere con le successive fasi sperimentali.
   NOTA: Gli ovociti vengono mantenuti a 37 °C durante tutte le fasi sperimentali. Per questo protocollo sono stati raccolti gli ovociti più grandi, che sono quelli completamente cresciuti.

2. Microiniezione di ovociti

NOTA: Per catturare l'attività basata sul citoscheletro nel citoplasma, viene utilizzato l'imaging in tempo reale in campo chiaro. La microiniezione di marcatori fluorescenti non è quindi necessaria e il protocollo può essere ripreso dalla fase 3. Per l'immagine del contorno nucleare, è stata utilizzata Rango, una sonda che mostra il tag YFP al suo N-terminale e un tag CFP al suo C-terminale^21,22. Quando viene fotografato in ovociti a 488 nm, etichetta l'intero nucleo, ad eccezione del nucleolo²³, e mostra un contorno nucleare molto nitido. Per visualizzare le macchioline nucleari, è stato utilizzato SRSF2-GFP (NM_011358), un marcatore delle macchioline nucleari¹¹. Lo stesso mezzo viene utilizzato per la raccolta degli ovociti, la microiniezione, la traduzione dell'RNA complementare e l'imaging di cellule vive.

1. Linearizzare il plasmide Rango con SfiI o il plasmide SRSF2-GFP con enzimi di restrizione AgeI.
2. Sintetizzare gli RNA complementari (cRNA) con il kit di trascrizione in vitro appropriato in base al promotore (T3 per Rango e T7 per SRSF2-GFP) e purificarli utilizzando un kit di purificazione su colonna, come descritto in precedenza²⁴.
   NOTA: RNA poliadenilato SRSF2-GFP che utilizza un kit di poliadenilazione per aumentare la stabilità del cRNA. Vengono utilizzati due diversi promotori a causa delle differenze nella spina dorsale del plasmide.
3. Misurare le concentrazioni di cRNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolumi.
4. Diluire il cRNA di Rango a 1000 ng/μL e il cRNA SRSF2-GFP a 600 ng/μL in dH₂O.
5. Centrifugare l'aliquota di cRNA a 4 °C per almeno 60 minuti a 25.000 x g prima della microiniezione.
6. Iniettare cRNA codificanti per YFP-Rango o SRSF2-GFP come descritto in^11,25 nel citoplasma degli ovociti in terreno M2+ BSA+Milrinone a 37 °C utilizzando un microiniettore.
7. Incubare gli ovociti per almeno 2 ore in terreno di coltura a 37 °C per la traduzione del cRNA.
8. Depositare gli ovociti in piccole goccioline di terreno di coltura (5 μL) su una piastra di coltura tissutale da 35 mm con fondo di vetro di copertura ricoperto di olio minerale. Posizionare un ovocita per gocciolina per evitare il fotosbiancamento degli ovociti vicini.

3. Imaging di cellule vive

NOTA: Gli ovociti di topo vivi sono stati esaminati con un microscopio confocale invertito dotato di un obiettivo ad immersione in olio Plan-APO 40x/1.25 NA, un piano di scansione motorizzato, una camera di incubazione (37 °C), una telecamera CCD accoppiata a una ruota portafiltri e un disco rotante. Le immagini ad alta risoluzione temporale vengono acquisite utilizzando Metamorph (di seguito denominato software di imaging) in modalità di acquisizione del flusso.

1. Aprire la finestra Acquisisci del software di imaging.
2. Impostare il tempo di esposizione su 500 ms, l'area della fotocamera su Full Chip e il binning su 1.
3. Nella scheda Acquisisci , impostare l'illuminazione per il canale richiesto. Per visualizzare l'attività citoplasmatica, illuminare gli ovociti con la luce trasmessa. Per ottenere l'immagine del nucleo marcato con YFP-Rango o SRSF2-GFP, illuminare gli ovociti con una lunghezza d'onda di eccitazione di 491 nm.
4. Per l'agitazione citoplasmatica o gli esperimenti YFP-Rango, concentrarsi sul nucleolo dell'ovocita che può essere facilmente osservato con la luce trasmessa (Figura 3A). Verrà acquisito un singolo piano. Per gli esperimenti con speckle nucleare, concentrarsi sulle goccioline di SRSF2-GFP (Figura 3C).
5. Nella scheda Speciale , impostare i parametri per ottimizzare la velocità di acquisizione come indicato di seguito.
   Otturatore della fotocamera: aperto per l'esposizione
   Modalità di cancellazione: CANCELLA PRESEQUENZA
6. Aprire la finestra Stream Acquisition (Acquisizione flusso) del software di imaging. Impostare i parametri di streaming in base all'esperimento. Per entrambi gli studi^10,11, utilizzare i parametri descritti di seguito.
   1. Nella scheda Acquisisci , impostare i seguenti parametri.
      Modalità di acquisizione: Stream to RAM
      Numero di fotogrammi: 480 (può essere ridotto a 240 fotogrammi per ridurre il tempo di imaging)
      Parametri della fotocamera: Acquisizione di immagini a frame rate
      Numero (Nb) di fotogrammi da saltare: 0
   2. Nella scheda Parametri controller fotocamera digitale , impostare i seguenti parametri.
      Stato della telecamera: HALT
      Modalità otturatore: APERTO MAI
      Modalità di cancellazione: CANCELLA PRESEQUENZA
      Numero di fotogrammi da mediare: 1
      NOTA 1: In modalità Stream, una volta impostato il tempo di esposizione, la durata del filmato è determinata dal numero di fotogrammi. Ad esempio, un tempo di esposizione di 500 ms e 480 fotogrammi generano un filmato di 4 minuti. È possibile visualizzare un'anteprima durante l'acquisizione dell'immagine.
7. Regolare un'area di interesse (ROI) attorno all'oggetto. Ridurre al minimo l'area del ROI riduce i tempi di acquisizione.
8. Fare clic su Acquisisci nella finestra Stream Acquisition per avviare il filmato.
9. Al termine dell'acquisizione, il filmato viene salvato come file .tif.
   NOTA: Per seguire le strutture nucleari durante i filmati ad alta risoluzione temporale, le sonde nucleari (YFP-Rango e SRSF2-GFP) devono avere un elevato rapporto segnale/rumore per facilitare la segmentazione degli oggetti durante le fasi successive dell'analisi delle immagini. I profili di espressione esogeni di SRSF2-GFP dovrebbero essere paragonabili alle immunocolorazioni a speckle nucleare endogene (Figura 3C-D). I cambiamenti nei profili di espressione di SRSF2-GFP rispetto alla colorazione endogena possono riflettere alte dosi di iniezione e traduzione di cRNA²⁶ (Figura 3C-D).

4. Analisi dell'immagine: agitazione citoplasmatica

NOTA: L'agitazione citoplasmatica che riflette l'intensità dell'attività citoscheletrica a base di actina negli ovociti è determinata da analisi di correlazione di immagini utilizzando un software di una precedente pubblicazione del laboratorio⁹ e disponibile su²⁷. Il software misura la quantità di intensità dei pixel conservata tra immagini consecutive. L'output è la perdita di correlazione tra le immagini nel tempo, a partire da 1 e decrescente esponenzialmente con il tempo, come in⁹.

1. Allinea le immagini time-lapse grezze (Δt=0,5 s) utilizzando il plug-in Fiji StackReg (Plugins>StackReg). Per installare il plug-in StackReg²⁸, abilitare il sito di aggiornamento BIG-EPFL²⁹ per ottenere l'accesso al plug-in.
2. Calcola le correlazioni dell'immagine in campo chiaro in 3 o 4 regioni citoplasmatiche di ~300 μm² seguendo i passaggi seguenti.
   1. Ritaglia le regioni e salvale come file di filmati separati. Apri la finestra Terminale.
   2. Digita ovocita, premi la barra spaziatrice , quindi premi Invio. Viene visualizzata una finestra denominata Signal and Slot. Scegli i file di filmato ritagliati che verranno analizzati.
      NOTA: È possibile selezionare più filmati contemporaneamente.
3. L'applicazione restituisce i file nella stessa cartella dei filmati. Vengono generati tre diversi file con estensioni .csv, .eps e .xls. Il file .xls contiene i dati per disegnare i grafici di correlazione per una regione. Valori medi di correlazione da diverse regioni all'interno di una cella.
4. Per motivi di chiarezza visiva, trasformare i valori di correlazione finali sottraendo il valore di ciascun punto temporale da 1 per ottenere una curva esponenziale invertita come in ¹¹.

5. Analisi delle immagini: mappe vettoriali citoplasmatiche

NOTA: Le mappe vettoriali citoplasmatiche degli ovociti di topo sono state generate dal plug-in Spatiotemporal Image Correlation Spectroscopy (STICS)³⁰ precedentemente implementato per rilevare i flussi citoplasmatici negli ovociti di topo³¹ su Fiji ³² e disponibile su ³³. Le mappe mostrano la velocità del flusso citoplasmatico, l'ampiezza e la direzione, come in⁹ e¹¹.

1. Converti le immagini time-lapse in campo chiaro (Δt=0,5 s) in formato a 32 bit.
2. Riallinea le immagini con il plug-in Fiji StackReg in Plugins > StackReg e scegli la trasformazione Rigid Body .
3. Con lo stack di plugin sottrai media mobile jru v2 (negli strumenti Detrend della suite di plugin STICS), sbarazzati delle strutture stazionarie nel film sottraendo l'immagine media temporale del film. Le caselle di controllo Sottrai media statica e Output sub stack, selezionare Mantieni media spaziale e impostare il periodo su 5.
4. Disegna un ROI attorno all'ovocita, escludendo la corteccia per evitare gli effetti di confine del plugin.
5. Avvia il plug-in STICS map jru V2 (negli strumenti ICS), con una dimensione della sottoregione di 32 pixel, una dimensione del passo di 16 pixel, uno spostamento temporale STICS di 3, offset X e Y di 0, un moltiplicatore di velocità di 8, una soglia di magnitudine di 0 e caselle di controllo di Normalizza lunghezza vettoriale, Vettori centrali, Velocità di output e Usa maschera filmato.
   NOTA: Il plugin genera una mappa dell'ovocita in formato .tif, visualizzando i flussi citoplasmatici come vettori con colori che indicano le ampiezze del flusso, come in⁹ e¹¹, e un file excel con le velocità di flusso misurate.

6. Analisi dell'immagine: fluttuazioni del contorno nucleare

NOTA: Le fluttuazioni del contorno nucleare che riflettono l'agitazione della membrana nucleare possono essere determinate da filmati di nuclei marcati con YFP-Rango (Figura 4A,C). L'analisi delle immagini per le fluttuazioni del profilo nucleare richiede Fiji e l'installazione dei plug-in StackReg (abilitare il sito di aggiornamento BIG-EPFL²⁹ per ottenere l'accesso al plug-in StackReg), PureDenoise³⁴ e Ovocyte_nucleus. Il plug-in StackReg esegue la registrazione delle immagini per correggere eventuali movimenti globali. Il plugin PureDenoise rimuove il rumore delle immagini multidimensionali corrotte dal rumore misto Poisson-Gaussian e smussa il contorno nucleare. Il plugin Ovocyte_nucleus sommizza il segnale e riempie il buco corrispondente al nucleolo in modo da creare una maschera di nucleo binario, riallinearla con StackRreg e calcolare la distanza r dal baricentro della maschera del nucleo alla circonferenza della maschera per tutti gli angoli θ (θ° da 0° a 360° con incrementi di 1°), come nella Figura 4. Tutti i codici per questi plugin possono essere trovati a ³⁵.

1. Su Fiji, nel menu Plugins > CIRB > Verlhac , selezionare Ovocyte Nucleus Shape.
2. Nella finestra di dialogo, effettuare le seguenti operazioni.
   1. Selezionare la cartella contenente i filmati da analizzare.
   2. Selezionare l'angolo θ (si può scegliere un valore da 1° a 360° ed è stato utilizzato un valore di 1° per una risoluzione ottimale del contorno), i margini per il ritaglio (si consigliano 5 μm per mantenere l'intero nucleo).
   3. Selezionare la calibrazione XY e l'intervallo di tempo. Fare clic su OK.
      NOTA: I risultati vengono forniti come file .xls in una cartella out nella cartella contenente i filmati originali. Questo file visualizza tutti i raggi r misurati per ogni volta t e ogni angolo θ. Un esempio di file di output è fornito nella Tabella supplementare 1. La cartella out contiene anche un filmato della maschera del nucleo.
3. Utilizzando un foglio di calcolo, calcola il raggio medio R su tutti i punti temporali t per ogni angolo θ definito. Ciò consente di tracciare la forma media nel tempo (Figura 4B). Vedere l'esempio nella tabella supplementare 2.
4. Per ogni t e θ si sottrae il raggio medio R nel tempo dal raggio r. La varianza (r-R)² è una misura delle fluttuazioni dell'inviluppo nucleare.
5. Calcola la media delle fluttuazioni per tutti i punti temporali t e tutti gli angoli θ per ogni nucleo ed eventualmente per tutti i nuclei di una condizione.
   NOTA: Quando la forma dei nuclei è significativamente alterata, come nel caso di un citoscheletro alterato, i nuclei marcati con YFP-Rango vengono ruotati sulle Figi per orientare la parte liscia verso l'alto e l'invaginazione verso il basso, prima di procedere con l'analisi delle fluttuazioni del contorno nucleare, come in¹⁰.

7. Analisi delle immagini: Movimenti di speckle nucleari (dinamica diffusiva)

NOTA: L'analisi del movimento dello speckle nucleare permette di dedurre il tipo di dinamica (guidata, diffusiva o confinata) di quegli organelli dalle loro tracce.

1. Selezionare immagini in modalità flusso di ovociti che esprimono goccioline SRSF2-GFP che si muovono principalmente sull'asse X-Y.
2. Correggere lo sbiancamento di immagini time-lapse di ovociti che esprimono SRSF2-GFP utilizzando il metodo di corrispondenza dell'istogramma nelle Figi (Regolazione dell'immagine > > Correzione della candeggina).
3. Riallinea le immagini con il plug-in Fiji StackReg.
4. Traccia i centri delle goccioline SRSF2-GFP utilizzando il plug-in Fiji Manual Tracking (Plugins > Tracking > Manual Tracking). Premere Aggiungi traccia per avviare il tracciamento e premere Termina traccia al termine. Non attivare la correzione di centratura.
5. Copiare le tracce in un foglio di calcolo per procedere con i calcoli degli spostamenti quadratici medi temporali (MSD) come in ¹¹ e calcolare gli MSD temporali da ogni traiettoria di goccioline di 20 s.
6. Adatta le curve (msd(t) = beta x t^α) con il metodo di Nelder-Mead utilizzando il software R per stimare l'esponente di diffusione alfa (α).
7. Misurare il coefficiente di diffusione efficace per poter confrontare le diverse condizioni poiché la diffusione dovrebbe essere anomala (α< 1).
8. Calcolare il coefficiente di diffusione effettivo D_eff da un adattamento lineare (alfa=1) sui primi 40 punti (20 s) della curva MSD temporale e normalizzare in base alla dimensione delle goccioline (D_eff in μm²/s x 3/2 πr in μm).

8. Analisi dell'immagine: fluttuazioni della superficie della macchia nucleare

NOTA: L'evoluzione del contorno della macchia nucleare nel tempo, una lettura della trasmissione della forza attiva su questi organelli, è stata misurata con un plug-in personalizzato Radioak³⁶ per l'uso nelle Fiji e disponibile su³⁷. Il plugin estrae i valori dei raggi di una data selezione per tutti gli angoli intorno al centro della selezione. La variazione di forma nel tempo è stata misurata confrontando il valore del raggio rispetto al suo valore medio per ciascun angolo. Il plugin permette di quantificare le fluttuazioni di forma e offre un'opzione per visualizzare queste dinamiche. Per installarlo, scarica il file Radioak_.jar e inseriscilo nella cartella plugins di Fiji. Riavvia Fiji. Questo plugin è una versione aggiornata del plugin utilizzato per analizzare le fluttuazioni del profilo nucleare di cui sopra e implementare una pipeline comparabile.

1. Nei filmati di flusso di goccioline SRSF2-GFP, selezionare goccioline più grandi di dimensioni comparabili (raggio ~2,5 μm).
   NOTA: Se le goccioline sono troppo piccole, una risoluzione insufficiente porterà a misurazioni aberranti delle fluttuazioni superficiali.
2. Ritagliare le immagini time-lapse di goccioline che si estendono per 15 s (Δt= 0,5 s) disegnando un rettangolo attorno alla gocciolina e selezionare Immagine > Ritaglio (Figura 5).
3. Riallinea le immagini con il plug-in Fiji StackReg in Plugins > StackReg e scegli la trasformazione Corpo rigido .
4. Uniforma l'immagine per rimuovere il rumore intorno alla gocciolina utilizzando l'opzione Uniforma Fiji in Elabora.
5. Crea una maschera binaria di droplet utilizzando l'opzione Converti in maschera nelle Figi in Elabora > binario. Utilizzare il metodo predefinito e scuro per lo sfondo (Figura 5).
6. Analizza la maschera di goccioline binarie generata utilizzando l'opzione Analizza particelle nelle Figi in Analizza, seleziona le opzioni Cancella risultati e Aggiungi a Manager e salva la regione di interesse (ROI) in RoiManager (Altro > Salva) in formato zip per essere letto da Radioak. Le ROI devono essere salvate in una cartella chiamata contours nella stessa cartella dei filmati, in file chiamati imagename_UnetCortex.zip per ogni filmato che deve essere trovato da Radioak.
7. Nel menu Fiji Plugins > CIRB > Radioak , selezionare Get Radii per elaborare un solo filmato o Do One Folder per analizzare tutti i filmati della stessa cartella.
   NOTA: Viene visualizzata una finestra per selezionare il numero dell'angolo e la scala. Radioak è stato lanciato con incrementi di angolo di 1° da 0° a 360° (input di 360) e sono stati estratti i valori dei raggi.
8. Selezionare il filmato o la cartella contenente i filmati da analizzare. I risultati vengono forniti come file .xls (uno per ogni filmato) in una directory radioakres nella cartella contenente i filmati originali. Ogni file visualizza tutti i raggi r misurati (in μm se il parametro scala è stato compilato) per ogni tempo t (in sezione) e ogni angolo (in radianti; Figura 5; si veda l'esempio di .xls output nella tabella supplementare 3).
9. Nel foglio di calcolo, calcola il raggio medio R su tutti i punti temporali t per ogni angolo definito (vedi esempio nella Tabella supplementare 4). Questo permette di tracciare la forma media nel tempo.
10. Tracciare la varianza (r-R)² in μm² che corrisponde alla misura delle fluttuazioni della superficie delle goccioline.

Risultati

I pannelli di immagini nella Figura 3 mostrano esempi di un tipico ovocita completamente cresciuto (Figura 3A), il nucleoplasma in un ovocita completamente cresciuto che esprime YFP-Rango (Figura 3B), il nucleoplasma in un ovocita completamente cresciuto che esprime un corretto (pannello di sinistra; Figura 3C) o un eccessivo (pannello di destra; Figura 3C) dose di cRNA SRS...

Discussione

I passaggi chiave di questo protocollo includono una corretta microiniezione di ovociti senza compromettere la loro sopravvivenza o la loro normale funzione ^9,10,11, nonché la microiniezione di quantità predefinite di cRNA che consentirebbero la corretta visualizzazione di strutture rilevanti, come le macchioline nucleari.

Stabilire il legame tra la dinamica citoplasmatica e quella (intra)nucleare ?...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 spinning disk	Yokogawa
DMI6000B microscope	Leica
Femtojet microinjector	Eppendorf
Fiji
Filter wheel	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph software	Universal Imaging,		version 7.7.9.0
Mineral oil	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
OF1 and C57BL/6 mice	Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3 CCD camera	QImaging
RNAeasy kit	Qiagen	74104
SC35 antibody	Abcam	ab11826	Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
Stripper Micropipette	XLAB Solutions		specialized for oocyte collection
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
Thermostatic chamber	Life Imaging Service
Windows Excel	Windows