Doppie registrazioni extracellulari nell'ippocampo del topo e nella corteccia prefrontale

Riepilogo

Questo protocollo delinea l'uso di un dispositivo di registrazione progettato su misura ed elettrodi per registrare i potenziali di campo locali e studiare il flusso di informazioni nell'ippocampo del topo e nella corteccia prefrontale.

Abstract

La tecnica di registrazione dei potenziali di campo locali (LFP) è un metodo elettrofisiologico utilizzato per misurare l'attività elettrica di popolazioni neuronali localizzate. Serve come strumento cruciale nella ricerca cognitiva, in particolare nelle regioni del cervello come l'ippocampo e la corteccia prefrontale. Le doppie registrazioni LFP tra queste aree sono di particolare interesse in quanto consentono l'esplorazione della comunicazione del segnale interregionale. Tuttavia, i metodi per eseguire queste registrazioni sono raramente descritti e la maggior parte dei dispositivi di registrazione commerciali sono costosi o mancano di adattabilità per adattarsi a specifici disegni sperimentali. Questo studio presenta un protocollo completo per l'esecuzione di registrazioni LFP a doppio elettrodo nell'ippocampo del topo e nella corteccia prefrontale per studiare gli effetti dei farmaci antipsicotici e dei modulatori dei canali del potassio sulle proprietà LFP in queste aree. La tecnica consente la misurazione delle proprietà LFP, compresi gli spettri di potenza all'interno di ciascuna regione del cervello e la coerenza tra i due. Inoltre, per questi esperimenti è stato sviluppato un dispositivo di registrazione a basso costo e progettato su misura. In sintesi, questo protocollo fornisce un mezzo per registrare segnali con elevati rapporti segnale-rumore in diverse regioni del cervello, facilitando l'indagine della comunicazione di informazioni interregionali all'interno del cervello.

Introduzione

I potenziali di campo locali (LFP) si riferiscono all'attività elettrica registrata dallo spazio extracellulare, che riflette l'attività collettiva di un gruppo localizzato di neuroni. Presentano una vasta gamma di frequenze, che vanno dalle onde lente a 1 Hz alle oscillazioni veloci a 100 Hz o 200 Hz. Bande di frequenza specifiche sono state associate a funzioni cognitive come l'apprendimento, la memoria e il processo decisionale ^1,2. I cambiamenti nelle proprietà LFP sono stati utilizzati come biomarcatori per vari disturbi neurologici, tra cui demenza e schizofrenia ^3,4. L'analisi delle registrazioni LFP può offrire preziose informazioni sui meccanismi patologici sottostanti associati a queste condizioni e sulle potenziali strategie terapeutiche.

La doppia registrazione LFP è una tecnica utilizzata per misurare l'attività elettrica localizzata all'interno e tra due specifiche regioni del cervello. Questa tecnica offre una preziosa opportunità per studiare le intricate dinamiche neurali e la comunicazione del segnale che si verificano all'interno e tra regioni cerebrali distinte. Studi precedenti hanno rivelato che rilevare alterazioni nelle proprietà neuronali delle singole regioni cerebrali può essere complesso, ma si possono osservare cambiamenti nella comunicazione corticale interregionale ^5,6. Pertanto, l'utilizzo della doppia registrazione LFP offre un potente mezzo per affrontare questo problema.

La connettività ippocampo-prefrontale svolge un ruolo cruciale nella modulazione delle funzioni cognitive e la disfunzione è stata collegata a vari disturbi neurologici ^7,8. Le registrazioni a doppio elettrodo di queste regioni possono fornire informazioni su queste interazioni. Sfortunatamente, ci sono informazioni limitate disponibili sui metodi per eseguire registrazioni LFP a doppio elettrodo tra queste aree. Inoltre, i dispositivi di registrazione disponibili in commercio sono generalmente costosi e mancano di adattabilità a specifici disegni sperimentali. Il metodo convenzionale per la registrazione degli LFP prevede l'utilizzo di un cavo schermato per collegare il dispositivo di registrazione agli elettrodi impiantati nel cervello di un animale. Tuttavia, questo approccio è suscettibile di artefatti di movimento e rumore ambientale, con un impatto sulla qualità e sull'affidabilità dei segnali registrati.

Questo protocollo descrive una procedura completa per l'esecuzione di registrazioni LFP a doppio elettrodo nell'ippocampo del topo e nella corteccia prefrontale, utilizzando un headstage a basso costo progettato su misura che può essere posizionato sulla testa dell'animale. Questi metodi consentono ai ricercatori di studiare i modelli oscillatori specifici della regione all'interno di due regioni cerebrali discrete ed esplorare lo scambio di informazioni interregionali e la connettività tra queste aree.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Florey Animal Ethics Committee (Università di Melbourne, n. 22-025UM) in conformità con il codice australiano per la cura e l'uso degli animali per scopi scientifici. Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6 (8 settimane), ottenuti dall'Animal Resources Centre (Australia).

1. Progettazione e fabbricazione dell'headstage

NOTA: La scheda PCB headstage è una scheda compatta a quattro strati da 14 mm x 12 mm progettata per essere posizionata direttamente sulla testa dell'animale. Utilizza un chip amplificatore commerciale (vedi Tabella dei materiali) e tutti i file di progettazione e Gerber sono disponibili online (link GitHub: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).

1. Fornire le seguenti specifiche al produttore: Spessore del pannello: 0,6 mm; Tracciamento/spaziatura minima: 4 mil; Dimensione minima del foro: 0,2 mm.
2. Durante il processo di assemblaggio del PCB, seguire questo ordine:
   1. Saldare il chip dell'amplificatore sulla scheda utilizzando una pistola ad aria calda impostata a 350 °C.
   2. Saldare i componenti passivi.
   3. Saldare il connettore SPI e il connettore dell'elettrodo (vedi Tabella dei materiali).
3. Ispezionare la saldatura al microscopio per garantire la qualità. Fissare il connettore SPI in posizione utilizzando resina epossidica per una maggiore stabilità.
4. Utilizzare un software di registrazione di terze parti e una scheda di controllo (vedere Tabella dei materiali) per l'acquisizione del segnale. Fare riferimento alla guida per l'utente del software per istruzioni dettagliate.
5. L'headstage progettato supporta 8 canali. Nel software, abilitare i canali 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 e 23 per la registrazione.

2. Fabbricazione di elettrodi

1. Tagliare i fili di tungsteno rivestiti in PFA (vedere la Tabella dei materiali) a lunghezze specifiche per diversi tipi di elettrodi: elettrodo della corteccia prefrontale (12 mm), elettrodo dell'ippocampo (10 mm) ed elettrodo di terra (6 mm).
2. Tagliare il tubo di ottone (vedi Tabella dei materiali) in segmenti di 3 mm.
3. Rimuovere 2 mm di rivestimento all'estremità di ciascun filo utilizzando un accendino, quindi saldare saldamente il filo dell'elettrodo al tubo di ottone. Il tubo in ottone ha un diametro interno di 0,45 mm e un diametro esterno di 0,60 mm.
4. Per l'elettrodo di terra, saldare una vite in acciaio inossidabile M1.2 (vedere la tabella dei materiali) all'elettrodo. Applicare un flusso a base di acido fosforico alla vite per migliorare la saldatura. Dopo la saldatura, pulire la vite con alcool.
   NOTA: Indossare guanti per proteggersi durante il processo di saldatura.

3. Procedura chirurgica

1. Anestetizzare il topo in una camera di anestesia con isoflurano al 3% e flusso di ossigeno di 1 L/min.
2. Posizionare il mouse anestetizzato su un termoforo e fissarlo in una cornice stereotassica (vedere Tabella dei materiali).
3. Regolare il tasso di mantenimento dell'isoflurano al 2,5-3% e ridurre il flusso di ossigeno a 500 ml/min. Usando il pizzico per le dita dei piedi, verifica se l'animale è ancora in anestesia profonda.
4. Iniettare per via sottocutanea carprofene a 0,5 mg/kg e applicare un unguento oculare per la protezione degli occhi.
5. Radere e sterilizzare la testa del topo utilizzando iodio povidone ed etanolo all'80%.
6. Praticare un'incisione di 8 mm lungo la linea mediana del cuoio capelluto, rimuovendo il tessuto connettivo nell'area dell'incisione.
7. Applicare acqua ossigenata per pulire la superficie del cranio, facendo attenzione a non toccare la pelle circostante.
8. Allineare i punti di riferimento bregma e lambda allo stesso livello per un posizionamento accurato degli elettrodi (bregma e lambda sono il punto in cui la sutura sagittale interseca le suture coronali e lambdoidi).
9. Praticare i fori per l'elettrodo di riferimento/rettificato, le viti di ancoraggio (fresa da 0.9 mm) e gli elettrodi attivi (fresa da 0.3 mm) alle coordinate specificate.
10. Collegare l'elettrodo su misura (passaggio 2) al braccio del telaio stereotassico e assicurarsi che sia perpendicolare al cervello.
11. Impiantare l'elettrodo nell'area CA1 dell'ippocampo (AP - 1,8 mm, ML - 1,3 mm, DV - 1,4 mm).
    NOTA: AP, anteroposteriore; ML, mediolaterale; DV, dorso-ventrale.
12. Impianto ripetuto di elettrodi nella corteccia prefrontale (AP - 2,0 mm, ML - 0,3 mm, DV - 1,7 mm).
13. Fissare gli elettrodi con un adesivo potente disponibile in commercio e cemento dentale (vedere la tabella dei materiali).
14. Impianto di due viti di ancoraggio da 1,2 mm (AP - 1,8 mm, ML -1,6 mm) per impedirne il movimento.
15. Posizionare l'elettrodo di riferimento/massa a diretto contatto con la dura madre, 2 mm posteriormente e 2 mm unilateralmente al punto di riferimento lambda.
16. Collegare il lato del tubo di ottone degli elettrodi a un connettore femmina multicanale (vedi Tabella dei materiali) con l'elettrodo di terra al centro.
17. Utilizzare una guaina termorestringente da 0,8 mm all'esterno del perno centrale per l'isolamento.
18. Fissare gli elettrodi, le viti di ancoraggio e il connettore con adesivo e cemento dentale.

4. Assistenza postoperatoria

1. Per alleviare il dolore postoperatorio, iniettare carprofene alla dose di 5-10 mg/kg per via sottocutanea ogni 12-24 ore sulla base di una valutazione del dolore per un periodo di tre giorni.
2. Fornire all'animale un periodo di recupero di una settimana prima di iniziare qualsiasi registrazione o procedura sperimentale.

5. Procedura di registrazione

1. Maneggiare l'animale per 15 minuti, due volte al giorno, per tre giorni consecutivi.
2. Prendi i topi chiudendo delicatamente la mano intorno a loro senza applicare una pressione eccessiva.
3. Posiziona la tavola headstage sulla testa dell'animale per 30 minuti una volta al giorno per tre giorni consecutivi.
4. Il giorno della registrazione, acclimata l'animale nella sala di registrazione per 30 minuti.
5. Posizionare l'animale in una piccola camera di registrazione all'interno di una gabbia di Faraday per ridurre le interferenze elettriche esterne. Allega l'headstage personalizzato per la registrazione.
6. Aprire il software di registrazione e selezionare una frequenza di campionamento di 2,00 kHz. Disabilita tutti i canali tranne 13 e 20 selezionando ciascun canale e premendo la barra spaziatrice.
7. Nella finestra della larghezza di banda hardware, impostare la larghezza di banda inferiore su 2 Hz e la larghezza di banda superiore su 100 Hz.
8. Nella finestra di filtraggio del software, regolare il filtro passa-basso su 100 Hz e il filtro passa-alto su 2 Hz.
9. Scegliere il percorso di archiviazione facendo clic su Seleziona nome file, quindi fare clic su Registra.
10. Iniziare ogni sessione di registrazione con un periodo di assuefazione di 10 minuti seguito da una registrazione EEG di base di 15 minuti.
11. Dopo la registrazione di base, somministrare il farmaco tramite iniezione intraperitoneale e continuare la registrazione per altri 30 minuti senza indugio.
    NOTA: Vedere la sezione Risultati per i dettagli sui farmaci utilizzati.

Risultati

I risultati qui mostrati dimostrano gli effetti di diversi farmaci sulle proprietà dei potenziali di campo locali (LFP) testati in quattro coorti di topi maschi C57BL/6 (n = 8 per ogni coorte; età: 8 settimane; peso: 24,0 ± 0,42 g). I farmaci testati includevano il farmaco antipsicotico clozapina, i modulatori dei canali del potassio 4-aminopiridina (4-AP) e la retigabina, nonché la soluzione salina del veicolo di controllo.

Come mostrato nella Figura 1, il to...

Discussione

Il protocollo qui presentato delinea la procedura per la costruzione di un headstage personalizzato specificamente progettato per la registrazione simultanea di potenziali di campo locali doppi (LFP) nell'ippocampo (HIP) e nella corteccia prefrontale (PFC). I passaggi dettagliati forniti in questo protocollo offrono informazioni sufficienti ai ricercatori per esaminare a fondo la comunicazione del segnale sia all'interno di ciascuna regione che tra HIP e PFC.

L'headstage progettato su misura u...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brass tube	Albion Alloys, USA	Inside diameter of 0.45 mm
Carprofen	Rimadyl, Pfizer Animal Health
Commercial amplifier chip	Intantech	RHD 2132
Control board	Intantech	RHD recording system
Dental cement	Paladur
Heat shrinks	Panduit	0.8 mm diameter
M1.2 stainless steel screw	Watch tools	Clock and watch screw
Multichannel socket connector	Harwin, AU	1.27 mm pitch, PCB socket
PFA-coated tungsten wires	A-M SYSTEMS, USA	Inside diameter of 150 µm
Phosphoric acid-based flux	Chip Quik	CQ4LF-0.5
Recording software	Intantech	RHX recording software
Stereotactic Frame	World Precision Instruments	Mouse stereotactic instrument
Super glue	UHU	Ultra fast