Analisi della tomografia microcomputerizzata del ginocchio in porcellini d'India Dunkin-Hartley invecchiati dopo iniezione intra articolare

Riepilogo

I porcellini d'India Dunkin-Hartley sono un modello animale consolidato per la ricerca sull'osteoartrite. Tali studi possono trarre beneficio dalle iniezioni intra-articolari per vari motivi, tra cui lo studio di nuovi agenti o il trattamento della malattia. Descriviamo una metodologia per le iniezioni intra-articolari del ginocchio nelle cavie e la successiva analisi della tomografia micro-computerizzata che valuta i cambiamenti del ginocchio associati all'artrite.

Abstract

Lo scopo di questo protocollo è guidare i ricercatori nell'esecuzione di una tecnica guidata dalla palpazione di iniezione intra-articolare del ginocchio in cavie e nella valutazione mediante micro-tomografia computerizzata. I porcellini d'India Dunkin-Hartley sono modelli robusti per la ricerca sull'osteoartrite poiché sviluppano spontaneamente l'artrosi alle ginocchia. La somministrazione intra-articolare di farmaci è un metodo comune per studiare gli effetti di un farmaco sperimentale in vivo. Nell'uomo, gli agenti terapeutici somministrati tramite iniezione intra-articolare possono offrire sollievo dal dolore e ritardare l'ulteriore progressione dell'osteoartrite. Come con qualsiasi specie, l'introduzione di un ago in uno spazio articolare ha il potenziale di causare lesioni, che possono provocare dolore, zoppia o infezione. Tali eventi avversi possono compromettere il benessere degli animali, confondere i risultati degli studi e richiedere ulteriori animali per raggiungere gli obiettivi dello studio. Pertanto, è imperativo sviluppare tecniche di iniezione adeguate per prevenire le complicanze, soprattutto negli studi longitudinali che richiedono iniezioni intra-articolari multiple e ripetute. Utilizzando la metodologia presentata, cinque porcellini d'India hanno ricevuto iniezioni bilaterali di ginocchio in anestesia generale. Sette giorni dopo l'iniezione, gli animali sono stati sottoposti a eutanasia umana per l'analisi della gravità dell'osteoartrite. Non si sono verificati eventi avversi a seguito di anestesia o iniezioni al ginocchio, inclusi zoppia, dolore o infezione. L'analisi della tomografia computerizzata a raggi X del ginocchio può rilevare cambiamenti patologici associati all'osteoartrite. I dati della tomografia microcomputerizzata indicano che l'osteoartrite è più grave negli animali più anziani, come indicato dall'aumento della densità minerale ossea e dello spessore trabecolare con l'età. Questi risultati sono coerenti con i cambiamenti istologici e i punteggi di Mankin modificati, un sistema di punteggio consolidato e ampiamente utilizzato per valutare la gravità dell'artrite in questi stessi animali. Questo protocollo può essere utilizzato per perfezionare le iniezioni intra-articolari nelle cavie.

Introduzione

L'osteoartrite (OA) colpisce 32,5 milioni di adulti statunitensi. È causata dalla progressiva perdita della cartilagine articolare, da una lieve infiammazione dei tessuti all'interno e intorno alle articolazioni e dalla formazione di osteofiti e cisti ossee ^1,2. I sintomi si manifestano tipicamente nelle fasi successive della malattia, con i trattamenti attuali che forniscono solo sollievo palliativo e hanno effetti collaterali sistemici. La mancanza di farmaci modificanti la malattia deriva da una scarsa comprensione dei meccanismi alla base della malattia³. Di conseguenza, c'è una necessità medica critica e continua di agenti migliorati per trattare l'OA.

Sono disponibili diversi modelli animali di OA che esaminano diversi componenti dei processi patologici⁴. Sebbene esistano diversi modelli chirurgici, tra cui la transezione del legamento crociato anteriore e la destabilizzazione del menisco mediale, questi sono invasivi e richiedono un alto livello di abilità tecnica⁵. I modelli indotti chimicamente sono procedure relativamente meno invasive tipicamente utilizzate per studiare i meccanismi del dolore OA⁶. Uno di questi modelli murini ampiamente utilizzati prevede l'induzione di OA mediante un'iniezione intra-articolare di iodoacetato monosodico (MIA) nel ginocchio. Questo modello genera un fenotipo simile al dolore riproducibile, robusto e rapido che può essere classificato modificando il dosaggio⁷ di MIA. I dettagli tecnici per l'induzione di questo modello sono stati precedentemente descritti⁷. La traduzione di questa tecnica in roditori più grandi, come i porcellini d'India, è difficile a causa delle loro differenze anatomiche. Alcune differenze includono l'aumento della muscolatura che circonda le ossa adiacenti e lo spazio articolare nella cavia e una fibula e una tibia articolate rispetto alla fusione distale osservata nei topi⁸. I porcellini d'india Dunkin-Hartley, un ceppo di porcellini d'india ampiamente disponibile, sono un modello animale di OA consolidato in quanto sviluppano naturalmente questa malattia, offrendo così un modello robusto per studiare gli effetti di nuove terapie somministrate per iniezione intra-articolare sulla progressione della malattia⁹. I porcellini d'India di Dunkin-Hartley iniziano a sviluppare l'OA a tre mesi, mentre i maschi mostrano uno sviluppo accelerato e un fenotipo¹⁰ più grave. Nelle cavie, l'OA progredisce con l'età e, a 12 mesi, la patologia associata è evidente all'imaging¹¹. I modelli spontanei di OA, come il modello di Dunkin-Hartley, non richiedono alcun intervento per indurre l'OA e quindi ricapitolano lo sviluppo e la progressione del fenotipo della malattia nell'uomo, fornendo così un potente modello traslazionale¹⁰. Inoltre, lo sviluppo spontaneo dell'OA consente il controllo interno quando nuove terapie vengono somministrate unilateralmente in un singolo ginocchio di un dato animale. Questo controllo interno riduce al minimo gli effetti delle variabilità tra gli animali durante l'analisi dei dati e può aiutare a ridurre il numero complessivo di animali.

L'analisi della micro tomografia computerizzata (μCT) a raggi X è un potente strumento che consente la valutazione quantitativa della gravità dell'OA¹². La μCT comporta la scansione di più immagini a raggi X ad alta risoluzione, ottenute da un campione rotante o da una sorgente di raggi X rotante e da un rivelatore¹³. Quindi, i dati volumetrici tridimensionali (3D) vengono ricostruiti sotto forma di sezioni di immagini impilate¹⁴. Poiché l'osso mineralizzato ha un eccellente contrasto al μCT, questa modalità può essere utilizzata per valutare le caratteristiche 3D ed eseguire analisi quantitative dei cambiamenti associati all'OA 15,16,17. La μCT offre diversi vantaggi rispetto agli strumenti più diffusi, tra cui l'istopatologia e l'analisi dell'andatura. A differenza della valutazione istologica di una o poche sezioni di tessuti, la μCT scansiona l'intera articolazione e offre una valutazione più olistica delle lesioni da OA¹⁸. Mentre l'analisi dell'andatura può discernere cambiamenti sintomatici nella funzione articolare nel tempo, i cambiamenti articolari si sviluppano molto prima dei cambiamenti funzionali associati all'OA. La μCT può fornire una misura più sensibile dello sviluppo di OA prima dell'insorgenza della zoppia. Due misure quantitative particolarmente rilevanti includono la densità minerale ossea e lo spessore trabecolare, poiché entrambi aumentano durante la progressione dell'OA^19,20. Può essere utile suddividere l'analisi in placca subcondrale e osso trabecolare, poiché hanno caratteristiche diverse, per ottenere misurazioni e confronti più robusti.

L'obiettivo generale di questo metodo è aiutare i ricercatori a eseguire con successo iniezioni intra-articolari su cavie. Il protocollo presentato utilizzava porcellini d'India Dunkin-Hartley maschi intatti di cinque (n=2), nove (n=1) e 12 (n=2) mesi; Le procedure possono essere estrapolate ad altri ceppi ed età di cavie che richiedono iniezioni intra-articolari del ginocchio. Nei modelli spontanei di OA, come il modello di Dunkin-Hartley, la progressione della malattia e la risposta al trattamento seriale sono spesso monitorate per lunghi periodi di tempo, che vanno dalle settimane ai mesi⁹. Questo protocollo esteso comporta più iniezioni intra-articolari, quindi è importante disporre di una tecnica di iniezione adeguata per prevenire eventi avversi, tra cui dolore, zoppia o infezioni, che possono influire sul benessere degli animali e confondere i risultati dello studio, richiedendo ulteriori animali durante lo studio. Il protocollo presentato descrive la metodologia delle iniezioni intra-articolari nelle cavie e la successiva analisi dei dati μCT.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Medical University of South Carolina. Lo studio ha seguito il principio delle 3R.

1. Preparazioni per iniezione intra-articolare

1. Lasciare che i porcellini d'India Dunkin-Hartley si acclimatino alla struttura per almeno una settimana prima di iniziare l'esperimento.
   NOTA: Sono stati utilizzati porcellini d'India maschi di 5- (n=2), 9- (n=1) e 12- (n=2) mesi. I maschi mostrano uno sviluppo accelerato e un fenotipo più grave di OA.
2. Radere la zona del ginocchio con un rasoio elettrico.
   NOTA: Fai attenzione ai capezzoli medialmente.
3. Anestetizzare la cavia in una camera di isoflurano che eroga il 3-5% di isoflurano in una miscela di O₂ (portata 2,5 L/min) e quindi trasferire la cavia in un cono nasale collegato a un circuito di anestesia non respiratorio. Regolare l'isoflurano per mantenere il piano chirurgico dell'anestesia durante l'iniezione, in genere con una portata di ossigeno di 0,5-1 L/min e 1-3% di isoflurano.
   NOTA: Le iniezioni intra-articolari causano un dolore lieve e momentaneo. Gli animali vengono anestetizzati durante la procedura per prevenire la percezione di stimoli dolorosi e migliorare l'accuratezza dell'iniezione. Nello studio presentato, la somministrazione di agenti analgesici, compresi i farmaci antinfiammatori non steroidei, interferirebbe con la progressione dell'OA²¹. A causa del dolore momentaneo, dell'anestesia fornita e del potenziale degli analgesici di confondere il modello, gli analgesici non sono stati somministrati a meno che gli animali non mostrassero effetti collaterali, tra cui zoppia e segni di dolore alla palpazione articolare dopo l'iniezione. Gli investigatori dovrebbero prendere in considerazione l'uso di analgesici per le iniezioni di routine. Gli analgesici sono raccomandati quando si verificano effetti collaterali. I regimi analgesici devono essere discussi con il veterinario istituzionale e approvati dall'IACUC prima di iniziare gli studi.
4. Assicurarsi che la cavia sia alla profondità di anestesia appropriata per mancanza di risposta al pizzicamento delle dita.
5. Applicare lubrificante oculare sterile su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione e le lesioni.
6. Diluire la betadina con acqua sterile al 10%.
7. Diluire l'etanolo a 200 gradi con acqua sterile al 70% di etanolo.
8. Preparare le soluzioni iniettabili, in una cabina di biosicurezza per mantenere la sterilità. Nel protocollo presentato, è stato utilizzato un veicolo sterile (1x soluzione salina tamponata con fosfato) per iniettare entrambe le ginocchia. Le soluzioni possono essere modificate in base agli obiettivi della ricerca.
   NOTA: Assicurarsi di diluire le soluzioni fresche per iniezione immediatamente prima della sessione di iniezione per garantire la sterilità. Eventuali soluzioni non utilizzate devono essere eliminate alla fine di ogni sessione di iniezione.
9. Riempire siringhe da insulina sterili monouso con soluzioni iniettabili. Fare attenzione a utilizzare il volume più piccolo possibile per evitare di sovraccaricare lo spazio articolare con il volume. Nel presente studio sono stati utilizzati 50 μl.
10. Posiziona il porcellino d'India e il cono del naso su una superficie pulita con un cuscinetto riscaldante per il supporto termico e un'imbottitura sotto la testa per sollevarla leggermente.
11. Indossare camice chirurgico, retina per capelli, guanti sterili e maschera durante l'esecuzione della procedura di iniezione.
12. Versare il 10% di betadine su un batuffolo di cotone e pulire entrambe le aree del ginocchio.
13. Versare il 70% di etanolo su un batuffolo di cotone e pulire entrambe le aree delle ginocchia.
14. Ripeti 1.12 e 1.13 altre due volte.
    NOTA: A scopo dimostrativo, il video corrispondente mostra la pulizia del ginocchio e del sito di iniezione una volta con il 10% di betadina e il 70% di etanolo. Il sito di iniezione è stato successivamente pulito con movimenti circolari altre due volte, alternando queste soluzioni. Si consigliano tre scrub seriali con soluzioni di scrub alternate e alcol per ottenere una tecnica asettica.

2. Iniezione intra-articolare

1. Metti la cavia in posizione supina per l'intera procedura.
2. Indossa un nuovo paio di guanti sterili e palpa l'articolazione del ginocchio.
   NOTA: Nel protocollo e nel video presentati, sono stati utilizzati guanti in nitrile autoclavati. Per la tecnica asettica devono essere utilizzati guanti sterili, compresi i guanti in nitrile autoclavati o i guanti chirurgici.
3. Flettere manualmente il ginocchio a 90°.
4. Spostare il dito distalmente alla rotula per individuare il solco dell'aspetto distale dello spazio articolare flettendo ed estendendo l'arto posteriore.
   NOTA: La rotula può essere palpata in questa posizione come una struttura piccola e solida situata direttamente sopra lo spazio articolare. La tibia può essere percepita come una struttura ossea distale alla rotula. Una volta determinata la posizione della tibia e della rotula, l'articolazione, percepita come un solco, si trova tra di loro, distale alla rotula e prossimale alla tibia.
5. Inserire con cautela l'ago da insulina sulla linea mediana distale alla rotula all'interno dello spazio articolare. L'ago deve essere inserito 1-2 mm sotto la pelle per entrare nello spazio articolare.
   NOTA: La finestra di accesso più grande per lo spazio articolare mentre il ginocchio è flesso si trova sulla parte anteriore dell'arto sulla linea mediana, direttamente distale alla rotula. L'iniezione sulla linea mediana in direzione antero-posteriore aiuterà a iniettare con precisione nello spazio articolare senza penetrare le strutture ossee. L'iniezione accurata nello spazio articolare può essere ottenuta utilizzando un approccio laterale-mediale, sebbene la finestra di accesso sia più stretta, soprattutto quando il ginocchio è flesso.
6. Iniettare lentamente 50 μl della soluzione nell'articolazione. Assicurarsi che l'ago si inserisca facilmente e che il contenuto venga iniettato senza resistenza.
   NOTA: Assicurati di non inserire l'ago troppo in profondità in quanto può causare danni alle articolazioni o alle ossa e provocare infiammazioni e/o dolore indesiderati. Se il solco corrispondente allo spazio articolare non viene trovato, l'ago potrebbe penetrare nel femore, nella rotula o nella tibia. Pertanto, è utile palpare con sicurezza il solco corrispondente allo spazio articolare per prevenire iniezioni peri-articolari o lesioni associate alla penetrazione di strutture ossee. Se si sviluppa una bolla nel sito di iniezione sotto la pelle, l'iniezione è stata troppo superficiale e il fluido è entrato nello spazio sottocutaneo. A seconda delle proprietà dell'agente utilizzato, il farmaco può entrare nello spazio articolare attraverso la diffusione, oppure può essere necessario un altro tentativo di iniezione.
7. Una volta fatto, gettare l'ago nel cestino per oggetti taglienti.
   NOTA: Per scopi pratici e di allenamento, iniettare un liquido contenente un colorante nello spazio articolare di un cadavere in un roditore o porcellino d'India di dimensioni simili. Quindi, sezionare l'articolazione per confermare la posizione dell'iniezione.
8. Massaggiare il ginocchio flettendo ed estendendo l'articolazione alcune volte favorisce la diffusione del farmaco all'interno dello spazio articolare.
9. Ripetere i passaggi 2.1-2.5 una volta sull'arto controlaterale con 1x soluzione PBS.

3. Recupero dall'iniezione intra-articolare

1. Spegni l'isoflurano e mantieni il flusso di ossigeno al 100% fino a quando l'animale non riprende conoscenza.
2. Posizionare l'animale su un termoforo per il supporto termico fino all'ambulatorio.
3. Applicare un impacco di ghiaccio sul ginocchio per 30 s con un tovagliolo di carta come barriera per aiutare a ridurre il gonfiore dovuto all'iniezione.
4. Valutare l'andatura degli animali durante la deambulazione prima di riportarli all'alloggio.
   NOTA: Se si notano anomalie dell'andatura, possono essere giustificati analgesici e cure di supporto. Si consiglia di valutare nuovamente la loro andatura diverse ore dopo il recupero dall'anestesia per garantire la normale mobilità.

4. Scansione con micro tomografia computerizzata (μCT)

1. Per il prelievo dei tessuti, stabilire un piano chirurgico di anestesia con il 100% di ossigeno e il 5% di miscela di isoflurano.
2. Confermare un piano chirurgico di anestesia con la mancanza di risposta a uno stimolo di pizzicamento delle dita. Sopprimere umanamente l'animale attraverso la somministrazione di ≥ 150 mg/kg di pentobarbital per via endovenosa secondo le politiche istituzionali e il protocollo di utilizzo animale approvato.
   NOTA: Nel protocollo presentato, ciascuna delle cinque cavie ha ricevuto un'iniezione in entrambe le ginocchia. Gli animali sono stati anestetizzati e sottoposti a eutanasia umana una settimana dopo l'iniezione.
3. Raccogli entrambi gli arti posteriori sezionando la pelle lontano dalla muscolatura circostante.
4. Successivamente, disarticolare l'arto posteriore con Rongeurs a metà dell'asta del femore e prossimalmente alla caviglia.
   NOTA: Il letto di scansione e il supporto per campioni utilizzati non erano in grado di ospitare l'intero zampa posteriore di un porcellino d'india adulto. I portacampioni di grandi dimensioni sono disponibili in commercio per campioni di dimensioni maggiori.
5. Porre i tessuti in una soluzione di formalina tamponata neutra per 72 ore per la fissazione prima di eseguire la μCT.
6. Aprire il software di scansione μCT e posizionare il campione con formalina in un contenitore compatibile che si inserirà nella cartella del campione μCT mantenendo il tessuto nel campo visivo.
7. Calibrare la macchina μCT per esposizioni in campo scuro e campo chiaro secondo le raccomandazioni del produttore.
8. Scansionare il campione con il filtro Al+Cu a 18 μm. Utilizzare il passo di rotazione di 0,7 ° per 360 ° con la fotocamera offset.
   NOTA: La scansione viene salvata automaticamente.

5. Elaborazione delle immagini per la valutazione dei parametri microarchitettonici ossei

1. Scarica e installa il software di ricostruzione μCT per la ricostruzione di immagini μCT.
2. Seleziona la cartella del software e fai doppio clic per aprire il software.
3. Seleziona una fetta dalle immagini μCT facendo clic su una fetta di immagine.
4. Scegli la destinazione del file di ricostruzione. Seleziona Sfoglia e crea una nuova cartella denominata Recon. Il formato del file selezionato dovrebbe essere BMP(8).
5. Controllare la compensazione del disallineamento.
   NOTA: Di solito, la stima è vicina a quella corretta, ma può essere regolata manualmente per spostare le immagini sovrapposte in modo che i bordi destro e sinistro siano allineati il più fedelmente possibile.
6. In Impostazioni, applica gli algoritmi Smoothing, Beam Hardening, CS Rotation e Ring Artifacts .
   NOTA: Può essere utile scegliere l'immagine di anteprima per determinare la chiarezza prima della ricostruzione. L'impostazione di regolazione fine può anche essere utile per determinare quali impostazioni sono le migliori.
7. Selezionare Avvia per iniziare l'elaborazione della ricostruzione.

6. Raccolta di dati microarchitettonici da immagini ricostruite

1. Scarica e installa Dataviewer.
2. Selezionare VOI e orientare il campione in modo che si allinei verticalmente per facilitare l'analisi in un secondo momento.
3. Salva il VOI modificato come nuova cartella.
4. Scarica e installa CTAnalyser per l'analisi delle proprietà ossee di parametri microarchitettonici.
   NOTA: La versione gratuita di CTAnalyser ha funzionalità limitate, quindi si consiglia di ottenere una licenza completa.
5. Suddividere l'analisi in base alla placca subcondrale e all'osso trabecolare salvandoli come intervalli separati di immagini.
   NOTA: Non è necessario dividere l'analisi, ma poiché la placca subcondrale e l'osso trabecolare hanno caratteristiche diverse, analisi separate possono aiutare con misurazioni e confronti robusti.
6. Seleziona l'intervallo di immagini da analizzare, a partire dalla piastra subcondrale facendo clic sulla porzione di immagine da cui vuoi iniziare.
7. Seleziona la regione di interesse per ogni immagine per assicurarti che includa l'osso facendo clic sulla scheda della regione di interesse.
8. Selezionare la scheda Selezione binaria . Regola l'istogramma in modo che lo sfondo e l'osso siano completamente separati.
9. Selezionare la scheda Densità minerale ossea (BMD). Salvare i dati in una nuova cartella dei dati di analisi.
10. Seleziona Elaborazione personalizzata e vai alla scheda Interna .
11. Per prima cosa esegui il Thresholding e seleziona Otsu automatico, quindi Esegui.
12. Quindi seleziona Elimina macchie e scegli Rimuovi macchie nere, quindi Esegui.
13. Ripeti Elimina macchie e scegli Rimuovi macchie bianche, quindi Esegui.
14. Selezionate Analisi 3D e Valori di base (Basic values ) e Valori aggiuntivi (Additional values).
15. Ripetere i passaggi 6.2.2-6.4.5 per reimpostare l'immagine per l'analisi dell'osso trabecolare.
    NOTA: Assicurarsi che il file di output si trovi in una nuova cartella con lo stesso file dei dati BMD.

Risultati

Prima di eseguire iniezioni intra-articolari su animali vivi, il protocollo di cui sopra è stato praticato su tre cadaveri di ratto per garantire la corretta posizione dell'iniezione. Durante le sessioni di pratica, 50 μl di nuovo colorante blu di metilene al 70% sono stati iniettati in entrambe le articolazioni del ginocchio utilizzando la metodologia sopra descritta. Ciò equivale a sei iniezioni pratiche. Dopo le iniezioni, l'articolazione del ginocchio è stata sezionata incidendo attraverso l'aspetto craniale dell...

Discussione

Nonostante i recenti progressi nel trattamento sintomatico dell'OA, vi è una completa mancanza di agenti terapeutici che prevengano l'insorgenza o ritardino la progressione dell'OA²⁴. Attualmente, l'unica cura per l'artrite reumatoide grave è la sostituzione articolare, che è costosa, invasiva e può causare morbilità e mortalità per i pazienti²⁵. Di conseguenza, c'è un disperato bisogno di continuare la ricerca con modelli animali di OA e lo sviluppo sostenuto di nuo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	sterilizing agent
3D.SUITE software	Bruker		μ-CT analyzing software
Betadine Surgical Scrub	Avrio Health	67618-151-16	sterilizing agent
Insulin syringe with needle	Ulticare	91008	to perform injections
Isoflurane	Piramal	803249	anesthesize animal
Neutral Buffered Formalin	Fisher Scientific	23-427098	Fix tissue
Nrecon Software	Bruker		μ-CT reconstruction software
Phosphate Buffered Saline	Cytiva	SH30258.01	control and diluting agent
SkyScan 1176	Bruker		to scan samples