Isolamento di cellule epiteliali pigmentate retiniche primarie suine per la modellazione in vitro

Riepilogo

Questo protocollo delinea la procedura per ottenere e coltivare cellule epiteliali pigmentate retiniche primarie (RPE) da occhi suini di provenienza locale. Queste cellule rappresentano un'alternativa di alta qualità alle cellule staminali e sono adatte per la ricerca retinica in vitro .

Abstract

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato cruciale nella retina esterna responsabile del supporto dei fotorecettori. La degenerazione RPE si verifica comunemente in malattie caratterizzate da perdita progressiva della vista, come la degenerazione maculare legata all'età (AMD). La ricerca sull'AMD spesso si basa sugli occhi di donatori umani o sulle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) per rappresentare l'RPE. Tuttavia, queste fonti di RPE richiedono periodi di differenziazione prolungati e una notevole esperienza per la coltura. Inoltre, alcuni istituti di ricerca, in particolare quelli nelle aree rurali, non hanno un facile accesso agli occhi dei donatori. Sebbene esista una linea cellulare RPE immortalizzata disponibile in commercio (ARPE-19), manca delle caratteristiche essenziali di RPE in vivo e non è ampiamente accettata in molte pubblicazioni di ricerca oftalmologica. C'è un urgente bisogno di ottenere cellule RPE primarie rappresentative da una fonte più prontamente disponibile ed economica. Questo protocollo chiarisce l'isolamento e la sottocoltura di cellule RPE primarie ottenute post-mortem da occhi suini, che possono essere reperite localmente da fornitori commerciali o accademici. Questo protocollo richiede materiali comuni che si trovano tipicamente nei laboratori di coltura tissutale. Il risultato è un'alternativa primaria, differenziata ed economica alle iPSC, agli occhi dei donatori umani e alle cellule ARPE-19.

Introduzione

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato situato nella retina esterna tra la membrana di Bruch e i fotorecettori¹. Le cellule RPE formano giunzioni strette con proteine come zonula occludens-1 (ZO-1) e possiedono un fenotipo distintivo caratterizzato da pigmentazione e morfologia esagonale ^2,3. Queste cellule contribuiscono alla barriera emato-retinica, supportando così la salute dei fotorecettori e mantenendo l'omeostasi retinica ^4,5. Inoltre, le cellule RPE svolgono un ruolo fondamentale nella visione assorbendo la....

Protocollo

Gli occhi utilizzati in questa procedura sono ottenuti post-mortem da una macelleria locale, ispezionata dall'USDA, e nessun lavoro viene eseguito utilizzando animali vivi. Dopo che gli animali sono stati sacrificati, passano circa 2 ore prima che gli occhi vengano enucleati. Poiché può iniziare a verificarsi la carie dei tessuti, è importante mantenere gli occhi freschi durante il trasporto per prevenire un'ulteriore carie. In questa procedura, gli occhi vengono immediatamente posti in frigorifero dopo l'enucleazione. Successivamente, la sacca di occhi viene posizionata all'interno di un becher in polipropilene da 1000 ml e circondata da ghiaccio all'interno di un re....

Discussione

Questo protocollo descrive come isolare le cellule RPE dagli occhi suini. La pigmentazione e la morfologia del ciottolo sono visibili entro 7 giorni dall'isolamento (Figura 1B). Inoltre, i dati TEER indicano la formazione di giunzioni strette²² e un monostrato sano (Figura 5). Questi risultati mostrano che le cellule RPE isolate con questo metodo sono simili all'RPE umano e possono essere utili nei modelli di coltura cellulare retinica.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass	Cellvis	P06-14-1-N
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062
Biosafety Cabinet
Calcium Chloride, Dried, Powder, 97%	Alfa Aesar	L13191.30
Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-548	one per eye
Centrifuge
Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Cooler, 8 L	Igloo	32529
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts	Fisher Scientific	07-200-154	Culture inserts
Cut Resistant Glove	Dowellife	712971375857
Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution	Fisher Scientific	SH3026401	for ICC dilutions only
Deionized Water
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate	Corning	10-013-CV
DNase I from Bovine Pancreas	Sigma Aldrich	DN25
DPBS/Modified - calcium - magnesium	Cytiva	SH3002B.02	stored at 4 °C
ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex)	Quansys Biosciences, Logan, UT
ENDOHM 6 TEER device	World Precision Instruments
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	232B20
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9706100
Flashlight
Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem	Fisher Scientific	LC146501
Gauze Sponges	Fisher Scientific	22-415-504	One per eye
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen	Thermo Scientific	A32728	RPE65 secondary antibody
Ice			Crushed prefered
Inverted Phase Contrast Microscope
Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	Fisher Scientific	R37605
Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5"	Cole-Palmer	EW-10818-05
Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide	Fisher Scientific	50-822-379
LSM-710 Confocal Microscope	Zeiss
Petri Dish, 100 mm x 20 mm	Corning	430167	one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste
Povidone-Iondine Solution, 10%	Equate	49035-050-34
RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen	Thermo Scientific	MA116578	RPE65 primary antibody
Scalpel Blades Size 10	Fisher Scientific	22-079-683
Scalpel Handles Style 3	Fisher Scientific	50-118-4164
Surgical Drape, 18 x 26"	Fisher Scientific	50-209-1792
Tissue Culture Incubator			37 °C, 5% CO2, 95% Humidity
Tissue Culture Plates, 6 Wells	VWR	10062-892	One for eye wash and one for seeding
Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL	Fisher Scientific	14-955-111F
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate	Corning	25053Cl
Tweezers Style 20A	Fisher Scientific	17-467-231
Tweezers Style 2A	Fisher Scientific	50-238-47	for removing neural retina
Tweezers Style 5-SA-PI	Fisher Scientific	17-467-168
Vacuum Aspiration System
Water Bath, 37 °C
ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen	Fisher Scientific	33-911-1	ZO-1 conjugated primary antibody