Immunoprecipitazione con un gel di affinità antiepitopo per studiare le interazioni proteina-proteina

Riepilogo

Le interazioni proteina-proteina sono importanti per chiarire la funzione delle proteine bersaglio e la co-immunoprecipitazione (co-IP) può facilmente confermare i PPI. Abbiamo trasfettato transitoriamente un plasmide codificante una proteina marcata con epitopo in cellule HEK-293 e sviluppato un metodo di immunoprecipitazione per confermare facilmente il legame di due proteine bersaglio.

Abstract

Le interazioni proteina-proteina (PPI) svolgono un ruolo fondamentale nei fenomeni biologici, come l'organizzazione cellulare, la trasduzione del segnale intracellulare e la regolazione trascrizionale. Pertanto, la comprensione dei PPI è un importante punto di partenza per ulteriori indagini sulla funzione della proteina bersaglio. In questo studio, proponiamo un metodo semplice per determinare il legame di due proteine bersaglio introducendo vettori di espressione di mammiferi nelle cellule HEK-293 utilizzando il metodo della polietilenimmina, lisando le cellule in un tampone di lisi proteica fatto in casa e abbassando le proteine bersaglio su un gel di affinità per tag epitopo. Inoltre, il PPI tra le varie proteine fuse con tag epitopo può essere confermato utilizzando anticorpi di affinità contro ciascun tag invece del gel di affinità tag epitopo. Questo protocollo potrebbe anche essere utilizzato per verificare vari PPI, compresi gli estratti nucleari, da altre linee cellulari. Pertanto, può essere utilizzato come metodo di base in una varietà di esperimenti PPI. Le proteine si degradano con un decorso temporale prolungato e ripetuti cicli di gelo-disgelo. Pertanto, la lisi cellulare, l'immunoprecipitazione e l'immunoblotting devono essere eseguite nel modo più fluido possibile.

Introduzione

Le proteine svolgono un ruolo importante in tutte le funzioni cellulari, tra cui l'elaborazione delle informazioni, il metabolismo, il trasporto, il processo decisionale e l'organizzazione strutturale. Le proteine mediano le loro funzioni interagendo fisicamente con altre molecole. Le interazioni proteina-proteina (PPI) sono importanti per mediare le funzioni cellulari, come la mediazione della trasduzione del segnale, il rilevamento dell'ambiente, la conversione dell'energia in movimento fisico, la regolazione dell'attività degli enzimi metabolici e di segnalazione e il mantenimento dell'organizzazione cellulare¹. Pertanto, i PPI possono esser....

Protocollo

La Figura 1 presenta una panoramica del protocollo.

1. Preparazione di soluzioni e tamponi

1. Tampone di lisi proteica: preparare il tampone di lisi proteica seguendo un rapporto precedentemente pubblicato⁷ (Tabella 1).
2. Tampone di lisi proteica + inibitore della proteasi (PI): aggiungere l'inibitore della proteasi (vedere la tabella dei materiali) al tampone sopra preparato (passaggio 1.1). Conservare a -20 °C.
3. Tampone campione: Miscelare 900 μL di 4x tampone campione Laemmli (vedere Tabella dei materia....

Discussione

Questo protocollo è quasi come i protocolli 5,7,14,15 precedentemente riportati. Il punto importante di questo protocollo è che non interrompiamo mai l'esperimento dalla fase di lisi cellulare alla fase di immunoprecipitazione. La degradazione delle proteine ostacola il rilevamento dei PPI. Il decorso prolungato e i ripetuti cicli di gelo-disgelo degradano le proteine. L'elettroforesi in SDS-.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA (pH8.0)	Nippon gene	311-90075
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL	Biorad	4561034
10x Tris/Glycine/SDS	Biorad	1610772
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	A2220
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep	GE Healthcare	NA931-1ML
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey	GE Healthcare	NA934-1ML
Cell Scraper M	Sumitomo Bakelite	MS-93170
Collagen I Coat Dish 100 mm	IWAKI	4020-010
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693132001
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Invitrogen	10565042
D-PBS (-)	FUJIFILM Wako	045-29795
Glycerol	FUJIFILM Wako	072-00626
Glycine	FUJIFILM Wako	077-00735
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724	Cell Signaling	C29F4
Laemmli Sample buffer	Bio-Rad Laboratories	161-0747
Micro Bio-Spin Chromatography Columns	Biorad	7326204
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels	Biorad	1658004JA
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse	Sigma	F3165
NaCl	FUJIFILM Wako	191-01665
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16	This paper	N/A
pcDNA3.1-HA-EHMT1	This paper	N/A
pcDNA3.1-vector	This paper	N/A
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride	PSI	24765
Penicillin-streptomycin solution	FUJIFILM Wako	168-23191
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo scientific	23227
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether	FUJIFILM Wako	168-11805
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate	FUJIFILM Wako	167-11515
Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs	Cytiva	17061801
Protein LoBind Tubes	eppendorf	30108442
ROTATOR RT-5	TAITEC	RT-5
skim milk	Morinaga	0652842
Stripping Solution	FUJIFILM Wako	193-16375
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack	Biorad	1704156B03
Trans-Blot Turbo System	Biorad	N/A
Trizma base	Sigma	T1503-1KG
USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS)	HyClone	SH30910.03
Veriblot	Abcam	ab131366
β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970	Cell Signaling	4970S