Regolazione della crescita delle cellule di Schwann mediante campo elettrico pulsato a nanosecondi per la rigenerazione dei nervi periferici in vitro

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per l'applicazione del campo elettrico a impulsi di nanosecondi (nsPEF) per stimolare le cellule di Schwann in vitro. La sintesi e la capacità di secrezione di fattori rilevanti e i cambiamenti del comportamento cellulare hanno convalidato il successo della stimolazione con nsPEF. Lo studio fornisce una visione positiva del metodo di rigenerazione dei nervi periferici.

Abstract

Le cellule di Schwann (SC) sono cellule mielinizzanti del sistema nervoso periferico, che svolgono un ruolo cruciale nella rigenerazione dei nervi periferici. Il campo elettrico a impulsi di nanosecondi (nsPEF) è un metodo emergente applicabile alla stimolazione elettrica nervosa che si è dimostrato efficace nello stimolare la proliferazione cellulare e altri processi biologici. Con l'obiettivo di valutare se le SC subiscono cambiamenti significativi nell'ambito della nsPEF e aiutare a esplorare il potenziale di nuovi metodi di rigenerazione dei nervi periferici, le cellule RSC96 in coltura sono state sottoposte a stimolazione con nsPEF a 5 kV e 10 kV, seguita da una coltivazione continua per 3-4 giorni. Successivamente, sono stati valutati alcuni fattori rilevanti espressi dalle SC per dimostrare il successo della stimolazione, tra cui la proteina marcatore specifica, il fattore neurotrofico, il fattore di trascrizione e il regolatore della mielinizzazione. I risultati rappresentativi hanno mostrato che la nsPEF ha migliorato significativamente la proliferazione e la migrazione delle SC e la capacità di sintetizzare fattori rilevanti che contribuiscono positivamente alla rigenerazione dei nervi periferici. Allo stesso tempo, una minore espressione di GFAP indicava la prognosi benigna delle lesioni dei nervi periferici. Tutti questi risultati mostrano che nsPEF ha un grande potenziale come metodo di trattamento efficiente per le lesioni dei nervi periferici stimolando le SC.

Introduzione

Ogni anno, milioni di persone sono colpite da lesioni nervose che coinvolgono sia il sistema nervoso periferico (SNP) che il sistema nervoso centrale (SNC)¹. Gli studi hanno dimostrato che la capacità di riparazione assonale del SNC è piuttosto limitata dopo lesioni nervose, mentre il PNS mostra una maggiore capacità a causa della significativa plasticità delle SC². Ciononostante, il raggiungimento della rigenerazione completa dopo lesioni dei nervi periferici rimane arduo e continua a rappresentare una sfida significativa per la salute umana ^3,4. Al giorno d'oggi, gli autotrapianti sono rimasti un trattamento comune nonostante gli svantaggi della morbilità del sito donatore e della disponibilità limitata⁵. Questa situazione ha spinto i ricercatori a esplorare terapie alternative, tra cui i materiali⁶, i fattori molecolari⁷ e la stimolazione elettrica (ES). Come fattore che promuove la crescita assonale e la rigenerazione nervosa⁸, la scelta di un metodo appropriato di ES e l'esplorazione della relazione tra ES e SC diventano essenziali.

Le SC sono le principali cellule gliali del SNP e svolgono un ruolo cruciale nella rigenerazione del PNS ^9,10. A seguito di lesioni dei nervi periferici, le SC subiscono una rapida attivazione, un'ampia riprogrammazione² e la transizione da uno stato di formazione della mielina a una morfologia di supporto alla crescita per condurre la rigenerazione del nervo². Una consistente proliferazione di SC si verifica all'estremità distale del nervo danneggiato, mentre le SC del moncone distale subiscono proliferazione e allungamento per formare la banda di Bungner, che sono necessarie per guidare gli assoni a crescere verso l'organo bersaglio¹¹. Inoltre, le SC dei monconi nervosi prossimali e distali migrano nel ponte nervoso per formare cordoni SC che promuovono la rigenerazione degli assoni¹². Inoltre, studi precedenti hanno dimostrato che la sintesi e la secrezione di fattori rilevanti correlati alle SC cambiano nei casi di rigenerazione dei nervi periferici, inclusi i fattori trascrizionali¹³, i fattori neurotrofici¹⁴ e i regolatori della mielinizzazione¹³. Sulla base di questi, la promozione della proliferazione, della migrazione, della sintesi e della secrezione di fattori rilevanti per migliorare la rigenerazione dei nervi periferici 15 è stata ampiamente studiata per migliorare la rigenerazione dei nervi periferici¹⁵.

Studi precedenti hanno dimostrato la possibilità di utilizzare l'ES per la rigenerazione nervosa¹. Una spiegazione ampiamente accettata è che l'ES può indurre la depolarizzazione delle membrane cellulari, alterare il potenziale di membrana e influenzare le funzioni delle proteine di membrana modificando le distribuzioni di carica su queste biomolecole¹. Tuttavia, la PEF intensa ampiamente applicata può causare dolore intenso, contrazioni muscolari involontarie e fibrillazione cardiaca⁸. Aumenta anche l'attività della creatinchinasi (CK), diminuisce la forza muscolare e induce lo sviluppo di indolenzimento muscolare a insorgenza ritardata (DOMS)¹⁶. nsPEF è una tecnica emergente che stimola i soggetti del test con campi elettrici ad alta tensione entro una durata di impulso di nanosecondi e viene gradualmente utilizzata nella ricerca a livello cellulare^17,18. Studi precedenti hanno riportato che il possibile razionale della nsPEF che promuove la proliferazione cellulare e l'attività degli organelli è la formazione di nanopori di membrana e l'attivazione dei canali ionici, che porta ad un aumento della concentrazione citoplasmatica di Ca^{2+ 19}. nsPEF utilizza la tecnologia di alimentazione a impulsi per caricare la membrana cellulare, producendo impulsi caratterizzati da breve durata, tempo di salita rapido, alta potenza e bassa densità di energia²⁰. Queste caratteristiche suggeriscono che la nsPEF potrebbe essere una modalità preferita con effetti collaterali di stimolazione minimi⁸. Inoltre, nsPEF offre vantaggi come procedure minimamente invasive, reversibilità, adattabilità e non distruttività dei tessuti neurali rispetto agli interventi chirurgici. Una delle principali direzioni di ricerca di nsPEF in campo biomedico è la sua applicazione per l'ablazione del tessuto tumorale utilizzando la stimolazione del campo elettrico ad alta energia 21,22,23. Alcuni risultati della ricerca indicano che il 12-nsPEF può stimolare i nervi periferici senza causare danni²⁴. Tuttavia, al momento, ci sono prove limitate riguardo l'applicazione di nsPEF nel campo della rigenerazione nervosa. Inoltre, stimolare le SC utilizzando nsPEF è un tentativo pionieristico, che contribuisce a ulteriori ricerche cliniche e in vivo. Questo studio esplora se la stimolazione nsPEF delle SC può promuovere la rigenerazione nervosa e fornire una base affidabile per successive ricerche approfondite e sistematiche.

Protocollo

1. Scongelamento di cellule RSC96 crioconservate

1. Scongelare il crioviale contenente 1 mL di sospensione cellulare agitandolo rapidamente in un bagno d'acqua a 37 °C, quindi aggiungerlo a una provetta da centrifuga contenente 4-6 mL di terreno di coltura completo e mescolare bene.
2. Centrifugare a 1000 x g per 3-5 minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 3 mL di terreno di coltura completo.
3. Aggiungere la sospensione cellulare a un pallone di coltura (o piatto) contenente 6-8 mL di terreno di coltura completo e incubare a 37 °C per una notte.
4. Il giorno successivo, osserva la crescita e la densità cellulare al microscopio.

2. Passaggio cellulare:

NOTA: Se la densità della cella raggiunge l'80%-90%, è pronta per il passaggio.

1. Eliminare il terreno di coltura e sciacquare le cellule 1-2 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza ioni calcio e magnesio.
2. Aggiungere lo 0,25% (p/v) di tripsina-0,53 mM EDTA al pallone di coltura (1-2 mL per un pallone T25, 2-3 mL per un pallone T75) e incubare a 37 °C per 1-2 min.
3. Osservare il distacco cellulare al microscopio. Se la maggior parte delle cellule diventa rotonda e si stacca, riportare rapidamente il pallone nell'area di lavoro, picchiettare delicatamente il pallone e aggiungere 3-4 mL di terreno di coltura contenente il 10% di FBS per fermare la digestione.
4. Mescolare il contenuto, aspirare la soluzione e centrifugare a 1000 x g per 5 min. Quindi, scartare il surnatante e risospendere le cellule aggiungendo 1-2 mL di terreno di coltura fresco e pipettando delicatamente.
5. Trasferire la sospensione cellulare in un nuovo matraccio T25 in rapporto 1:2 e aggiungere 7 mL di terreno di coltura.

3. Funzionamento del dispositivo nsPEF

1. Risospendere le cellule RSC96 in 1 mL di terreno di coltura DMEM e trasferirle in piastre colorimetriche con elettrodi su entrambi i lati.
2. Accendere l'interruttore di alimentazione.
3. Regolare i parametri ruotando la manopola sullo strumento per modificare l'intensità del campo elettrico. Le intensità stabilite in questo studio sono 5 kV/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm e 40 kV/cm.
4. Ruotare con cautela gli elettrodi fino a quando non compaiono scintille, consentendo alle celle di ricevere 5 impulsi di nsPEF in base alle intensità di campo preimpostate prima di separare immediatamente i due elettrodi. Dopo questo trattamento, prelevare le cellule del gruppo sperimentale trattate con nsPEF e le cellule del gruppo di controllo non trattate per eseguire le sezioni 4-6, rispettivamente, dopo un certo periodo di coltura cellulare (1 giorno in questo esperimento).

4. Saggio del kit di conteggio cellulare-8 (CCK-8)

1. Preparare una sospensione cellulare di una particolare concentrazione da cellule RSC96 stimolate con stimolazione elettrica. Aggiungere 100 μl di sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra per coltura cellulare a 96 pozzetti. Considerando i requisiti del test CCK-8, controllare il numero totale di cellule nel kit di reagenti tra 1 x 10³ e 1 x 10⁶.
2. Prelevare 10 μL di soluzione CCK-8 dal kit e aggiungerli alla piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti. Incubare in un incubatore di CO₂ a 37 °C per altri 30 minuti - 4 ore.
3. Misurare l'assorbanza. Utilizza la misurazione a doppia lunghezza d'onda con una lunghezza d'onda di rilevamento di 430-490 nm e una lunghezza d'onda di riferimento di 600-650 nm.
4. Determinare l'intensità dell'intensità di campo per gli esperimenti successivi in base ai risultati sperimentali della proliferazione cellulare. Selezionare le cellule con una buona proliferazione per gli esperimenti successivi.

5. Saggio di graffio cellulare

1. In ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti, seminare 3 x 10⁵ celle con un volume totale di 2 mL per pozzetto. Circa 72 ore dopo, le celle copriranno il pozzo. Condurre il test sul gruppo sperimentale e su quello di controllo separatamente.
2. Utilizzare la punta di una pipetta per tracciare una linea orizzontale sul fondo del pozzetto di coltura. Assicurarsi che il puntale della pipetta sia tenuto in verticale e cercare di evitare di inclinarlo.
3. Aspirare il terreno di coltura e lavare con PBS 2-3 volte.
4. Aggiungere 2 ml di terreno privo di siero in ogni pozzetto.
5. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C. Scattare foto con un ingrandimento quadruplo del microscopio invertito a 0 ore e 24 ore per osservare i cambiamenti nella migrazione cellulare.

6. Immunofluorescenza

1. Permeabilizzazione cellulare:
   1. Dopo aver pipettato delicatamente le sospensioni cellulari nei piatti di coltura, disegnare dei cerchi con un pennarello istologico nei punti in cui le cellule sono distribuite uniformemente sul vetrino coprioggetti. Trattare separatamente il gruppo di controllo e i diversi gruppi sperimentali.
   2. Aggiungere 50-100 μL di soluzione di lavoro per permeabilizzazione (0,25-0,5% Triton X-100) e incubare a temperatura ambiente (RT) per 20 min. Lavare tre volte con PBS per 5 minuti ogni volta.
2. Blocco del siero: aggiungere il 3% di BSA all'interno dei cerchi per coprire uniformemente il tessuto. Incubare a RT per 30 min.
3. Incubazione dell'anticorpo primario: rimuovere delicatamente la soluzione bloccante e aggiungere l'anticorpo primario opportunamente diluito (derivato dal topo, diluito a 1:300) nei pozzetti cellulari. Collocare la piastra per colture cellulari in una scatola umida e incubare per una notte a 4 °C.
4. Incubazione secondaria degli anticorpi: Posizionare la piastra cellulare su uno shaker e lavarla tre volte per 5 minuti ogni volta. Aggiungere l'anticorpo secondario corrispondente (IgG di capra anti-topo marcato con CY3, diluito a 1:300) e incubare a RT per 50 minuti.
5. Colorazione nucleare DAPI:
   1. Posizionare il vetrino coprioggetti in PBS (pH 7,4) su uno shaker e lavare tre volte per 5 minuti ogni volta.
   2. Dopo aver asciugato delicatamente il vetrino, aggiungere la soluzione di colorazione DAPI (2 μg/mL, 0,5 mL per cerchio) all'interno dei cerchi e incubare a RT per 10 minuti in una camera buia.
6. Montaggio: Posizionare il vetrino coprioggetti in PBS (pH 7,4) su uno shaker e lavare tre volte per 5 minuti ogni volta. Dopo aver asciugato delicatamente il vetrino, sigillare il vetrino coprioggetti con un mezzo di montaggio anti-sbiadimento per la fluorescenza.
7. Acquisizione dell'immagine: eccitare DAPI a una lunghezza d'onda di 330-380 nm e rilevare l'emissione a 420 nm; eccitare a 465-495 nm e rilevare l'emissione a 515-555 nm per AF488; eccitare a 510-560 nm e rilevare l'emissione a 590 nm per CY3; eccitare a 608-648 nm e rilevare l'emissione a 672-712 nm per CY5.

Risultati

I campi elettrici pulsati a bassa intensità stimolano la proliferazione cellulare
Secondo il test CCK-8, il tasso di proliferazione di RSC96 nel gruppo 5 kV/cm era significativamente più veloce di quello delle cellule del gruppo di controllo. Tuttavia, all'aumentare dei parametri (20 kV/cm e 40 kV/cm), il tasso di proliferazione era instabile, persino inferiore a quello del gruppo di controllo. Il tasso di proliferazione cellulare delle cellule RSC96 nel gruppo 40 kV/cm era significativamente inferi...

Discussione

Negli ultimi anni, l'applicazione di nsPEF ha registrato una crescita stimolante, come riportato. nsPEF ha un effetto altamente mirato solo sull'area desiderata, fornendo energia sufficiente per il trattamento senza causare ulteriori danni termici, rendendolo più sicuro per il corpo umano²⁸. Queste caratteristiche gli conferiscono promettenti prospettive traslazionali nel trattamento dei tumori e nella rigenerazione nervosa. Tuttavia, alcuni studi hanno proposto alcune limitazioni di nsPEF. Rispe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade mounting medium	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1401
Anti-GFAP Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB12100-100
Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB12144-100
Anti-S100 beta Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB14146-100
BSA	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GC305010
Coverslip	Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD	10212432C
CY3-labeled goat anti-mouse IgG	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB21302
DAPI Staining Reagent	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1012
Decolorizing shaker	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	DS-2S100
High Voltage Power Supply for nsPEF	Matsusada Precision Inc.	AU-60P1.6-L
Histochemical pen	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G6100
Membrane breaking liquid	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1204
Microscope slide	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G6012
Palm centrifuge	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	MS6000
PBS powdered	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G0002
Pipette	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
Positive fluorescence microscope	Nikon, Japan	NIKON ECLIPSE C1
Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibody	Beijing Bioss Biotechnology Co., LTD	BS-20563R-AF488
RSC96 Schwann cells	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	STCC30007G-1
scanister	3DHISTECH	Pannoramic MIDI
Special cable for nsPEF	Times Microwave Systems	M17/78-RG217
Turbine mixer	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	MV-100