Preparazione e analisi di vetrini istologici di bulbi oculari di ratto e topo per la valutazione della retina

Riepilogo

Questo manoscritto presenta un protocollo per la preparazione istologica di vetrini da bulbi oculari di roditori. Con il metodo proposto, la retina interna può essere facilmente visualizzata e valutata al microscopio ottico. La procedura è presentata per i bulbi oculari di topi e ratti.

Abstract

Un bulbo oculare di roditore è un potente strumento per la ricerca dei meccanismi patologici di molte malattie oftalmiche, come il glaucoma, la retinopatia ipertensiva e molte altre. Gli esperimenti preclinici consentono ai ricercatori di esaminare l'efficacia di nuovi farmaci, sviluppare nuovi metodi di trattamento o cercare nuovi meccanismi patologici coinvolti nell'insorgenza o nella progressione della malattia. L'esame istologico fornisce molte informazioni necessarie per valutare gli effetti degli esperimenti condotti e può rivelare degenerazioni, rimodellamento tissutale, infiltrazioni e molte altre patologie. Nella ricerca clinica, raramente c'è la possibilità di ottenere un tessuto oculare adatto a un esame istologico, motivo per cui i ricercatori dovrebbero sfruttare l'opportunità offerta dall'esame dei bulbi oculari dei roditori. Il manoscritto presenta un protocollo per la preparazione istologica delle sezioni dei bulbi oculari dei roditori. La procedura è presentata per i bulbi oculari di topi e ratti e prevede le seguenti fasi: (i) raccolta del bulbo oculare, (ii) conservazione del bulbo oculare per ulteriori analisi, (iii) elaborazione del tessuto in paraffina, (iv) preparazione di vetrini, (v) colorazione con ematossilina ed eosina, (vi) valutazione del tessuto al microscopio ottico. Con il metodo proposto, la retina può essere facilmente visualizzata e valutata in dettaglio.

Introduzione

Il bulbo oculare è una struttura simile a un globo che costituisce l'organo della vista. L'interno del bulbo oculare può essere diviso in due segmenti: il segmento anteriore, che comprende la cornea, l'iride, il corpo ciliare, il cristallino, la camera anteriore e la camera posteriore, e il segmento posteriore, che comprende il corpo vitreo, la retina, la coroide, la sclera, la testa del nervo ottico. La camera anteriore si trova tra la cornea e l'iride ^1,2. L'iride è una struttura circolare con un'apertura al centro chiamata pupilla. All'incrocio tra la cornea e l'iride, c'è ....

Protocollo

La ricerca è stata condotta nel rispetto delle linee guida istituzionali. I bulbi oculari utilizzati in questo studio sono stati ottenuti da animali inclusi in un esperimento condotto sulla base del numero di approvazione dello studio WAW2/122/2020 emesso dal 2^° Comitato Etico Locale presso l'Università di Scienze della Vita di Varsavia, in Polonia. Il nostro protocollo è stato sviluppato esaminando topi di età compresa tra 11 e 44 settimane e ratti di età compresa tra 6, 12 e 16 settimane.

1. Preparazione dei bulbi oculari del mouse

NOTA: Questo protoco....

Risultati

Con l'uso del protocollo presentato, l'anatomia e la morfologia di strutture specifiche del bulbo oculare possono essere valutate in dettaglio. Il nostro team si concentra sulla ricerca dei meccanismi patologici della neurodegenerazione nei disturbi della retina, come il glaucoma, la retinopatia diabetica e la retinopatia ipertensiva. Per valutare le caratteristiche della neurodegenerazione nella retina, abbiamo valutato l'RT (bulbo oculare del topo -Figura 2

Discussione

Un esame istologico del bulbo oculare del topo e del ratto è uno strumento potente nel campo dell'oftalmologia sperimentale. Può fornire nuove informazioni relative ai cambiamenti nelle strutture oculari nel corso di malattie oftalmiche, che altrimenti non sarebbero osservati in ambito clinico. I protocolli descritti presentano un metodo semplice per condurre un'analisi istologica della retina. Le sottigliezze della procedura necessaria per elaborare i tessuti anteriori, come la cornea.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Chempur	111024800
Dumont Tweezers #5, 11cm, 0.05 x 0.01mm Tips	World Precision Instruments	14095	small, microsurgical forceps
Eosin	Mar-Four	4P.05.2001/L	Aqueous solution
Ethyl alcohol 96 %	Chempur	CH.ET.AL.96%CZDA.CH
Ethyl alcohol 99.9 %	Chempur	CH.ETYL.ALK.99,9%BW	Use to prepare 70% and 80% solutions of EtOH
Glacier - 86 °C Ultralow Temperature Freezer NU-9483E	NuAire	13027D0034	Freezing temperature - 80 °C
Glass slides	Mar-Four	MI.15.01673	Ground glass slides with a double-sided matte field for description
Leica CV5030 Fully Automated Glass Coverslipper	Leica Biosystems	14,04,78,80,101	Automated slide sealer
Mayer's hematoxylin	Chempur	124687402
Metal base molds 15 mm  x 15 mm	Leica Biosystems	3803081
Microme HM 340 E	Thermo Scientific	90-519-0	Microtome
Microtome razor blades	Mar-Four	HI.N.35	Cutting angle 35°
Micro-Twin biopsy cassette	Mar-Four	LN.13874550
Microwave Hybrid Tissue Processor	Milestone
Multistainer Leica ST5020	Leica Biosystems		Automated slide stainer
NanoZoomer 2.0-HT slide scanner	Hamamatsu	C9600	Histopathological slide scanner
NDP.view2 Image viewing software	Hamamatsu	U12388-01	Image viewing software
Paraffin Pathowax Plus	Mar-Four	4P.PWP.010	Melting temperature 56 °C - 58 °C
Paraformaldehyde	Sigma - Aldrich	441244-1KG	Prepare a 4% solution in PBS
PBS Tablets	Merck Millipore	524650-1EA	Use to prepare a solution of phosphate buffer saline, per manufacturer's instructions
Pierce Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Thermo Scientific	69715
Refrigerator-freezer EN14000AW	Electrolux	925032562-00	refrigeration 4 °C
Scalpel blade	Swann-Morton	T.OST.SKAL00.024
Sucrose	Chempur	427720906
SuperCut Spring Scissors, 12.5cm, Curved	World Precision Instruments	501925	curved, small microsurgical scissors
Tape for automatic sealers	Mar-Four	KP-3020/SMRH001
Xylene	Chempur	CH.KSYL.5l.METAL.OP