Isolamento dei mitocondri per l'analisi dei supercomplessi mitocondriali da piccoli campioni di tessuti e colture cellulari

Riepilogo

Questo protocollo descrive una tecnica per l'analisi dei supercomplessi respiratori quando sono disponibili solo piccole quantità di campioni.

Abstract

Negli ultimi decenni, le prove accumulate sull'esistenza di supercomplessi respiratori (SC) hanno cambiato la nostra comprensione dell'organizzazione della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali, dando origine alla proposta del "modello di plasticità". Questo modello postula la coesistenza di diverse proporzioni di SC e complessi a seconda del tessuto o dello stato metabolico cellulare. La natura dinamica dell'assemblaggio nelle SC consentirebbe alle celle di ottimizzare l'uso dei combustibili disponibili e l'efficienza del trasferimento di elettroni, minimizzando la generazione di specie reattive dell'ossigeno e favorendo la capacità delle celle di adattarsi ai cambiamenti ambientali.

Più recentemente, sono state riportate anomalie nell'assemblaggio SC in diverse malattie come le malattie neurodegenerative (morbo di Alzheimer e Parkinson), la sindrome di Barth, la sindrome di Leigh o il cancro. Il ruolo delle alterazioni dell'assemblaggio SC nella progressione della malattia deve ancora essere confermato. Tuttavia, la disponibilità di quantità sufficienti di campioni per determinare lo stato dell'assemblaggio SC è spesso una sfida. Questo accade con biopsie o campioni di tessuto che sono piccoli o devono essere divisi per analisi multiple, con colture cellulari che hanno una crescita lenta o provengono da dispositivi microfluidici, con alcune colture primarie o cellule rare, o quando si deve analizzare l'effetto di trattamenti particolarmente costosi (con nanoparticelle, composti molto costosi, ecc.). In questi casi, è necessario un metodo efficiente e facile da applicare. Questo articolo presenta un metodo adattato per ottenere frazioni mitocondriali arricchite da piccole quantità di cellule o tessuti per analizzare la struttura e la funzione delle SC mitocondriali mediante elettroforesi nativa seguita da saggi di attività in-gel o western blot.

Introduzione

I supercomplessi (SC) sono associazioni supramolecolari tra singoli complessi della catena respiratoria ^1,2. Dall'identificazione iniziale delle SC e dalla descrizione della loro composizione da parte del gruppo di Schägger ^2,3, successivamente confermata da altri gruppi, è stato stabilito che esse contengono i complessi respiratori I, III e IV (CI, CIII e CIV, rispettivamente) in diverse stechiometrie. Si possono definire due principali popolazioni di SC, quelle contenenti CI (e CIII da solo o CIII e CIV) e con peso molecolare molto elevato (MW, a par....

Protocollo

NOTA: La composizione di tutti i terreni di coltura e dei tamponi è specificata nella Tabella 1 e i dettagli relativi a tutti i materiali e i reagenti utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Isolamento dei mitocondri da coltura cellulare

NOTA: Il volume minimo di cellule analizzate è stato di ~30-50 μL di celle impaccate (passaggio 1.4). Questo può corrispondere approssimativamente ad almeno due o tre piastre di coltura cellulare da 100 mm o a una piastra da 150 mm all'80-90% della confluenza, a seconda del tipo di cellula (tra....

Discussione

Gli adattamenti metodologici introdotti nei protocolli qui descritti hanno lo scopo di evitare perdite e aumentare la resa mantenendo le attività del complesso mitocondriale (che è cruciale quando la disponibilità di quantità sufficienti di campioni è compromessa) e riprodurre il modello atteso di SC del tessuto o della linea cellulare (vedi Figura 2C). A questo scopo e poiché non è richiesta un'elevata purezza mitocondriale per rilevare correttamente le SC, il numero di passaggi, tem.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	PanReac	131008
Aminocaproic acid	Fluka Analytical	7260
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Bis Tris	Acrons Organics	327721000
Bradford assay	Biorad	5000002
Coomassie Blue G-250	Serva	17524
Coomassie Blue R-250	Merck	1125530025
Cytochrome c	Sigma-Aldrich	C2506
Diamino  benzidine (DAB)	Sigma-Aldrich	D5637
Digitonin	Sigma-Aldrich	D5628
EDTA	PanReac	131669
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Fatty acids free BSA	Roche	10775835001
Glycine	PanReac	A1067
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
K2HPO4	PanReac	121512
KH2PO4	PanReac	121509
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Methanol	Labkem	MTOL-P0P
MgSO4	PanReac	131404
Mini Trans-Blot Cell	BioRad	1703930
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
MTCO1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459600
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NADH	Roche	10107735001
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels	Invitrogen	BN1001BOX
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x)	Invitrogen	BN2002
NativePAGE Running Buffer (20x)	Invitrogen	BN2001
NDUFA9 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459100
Nitroblue tetrazolium salt (NBT)	Sigma-Aldrich	N6876
Pb(NO3)2	Sigma-Aldrich	228621
PDVF Membrane	Amersham	10600023
Phenazine methasulfate (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625
Pierce ECL Substrate	Thermo Scientific	32106
PMSF	Merck	PMSF-RO
SDHA Monoclonal Antibody	Invitrogen	459200
Sodium succinate	Sigma-Aldrich	S2378
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
Tris	PanReac	A2264
UQCRC1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459140
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001