Istituzione di un modello di impianto embrionale in vitro

Riepilogo

Questo protocollo descrive le metodologie per stabilire un modello di impianto embrionale in vitro semplice ed efficiente per valutare le molecole rilevanti che influenzano il processo di impianto dell'embrione.

Abstract

L'impianto dell'embrione è il primo passo per l'instaurazione di una gravidanza di successo. Un modello in vitro per l'impianto dell'embrione è fondamentale per la ricerca biologica di base, lo sviluppo di farmaci e lo screening. Questo articolo presenta un modello in vitro semplice, rapido e altamente efficiente per l'impianto dell'embrione. In questo protocollo, introduciamo prima l'acquisizione di blastocisti di topo e la preparazione di cellule di adenocarcinoma endometriale umano (Ishikawa) per l'impianto, seguita dal metodo di co-coltura per embrioni di topo e cellule di Ishikawa. Infine, abbiamo condotto uno studio per valutare l'impatto di concentrazioni variabili di 17-β-estradiolo (E₂) e progesterone (P4) sui tassi di adesione degli embrioni sulla base di questo modello. I nostri risultati hanno rivelato che alte concentrazioni di E₂ riducono significativamente l'adesione dell'embrione, mentre l'aggiunta di progesterone potrebbe ripristinare il tasso di adesione. Questo modello offre una piattaforma semplice e veloce per la valutazione e lo screening delle molecole coinvolte nel processo di adesione, come citochine, farmaci e fattori di trascrizione che controllano l'impianto e la ricettività endometriale.

Introduzione

L'impianto dell'embrione, la fase iniziale di una gravidanza di successo, è fondamentale per comprenderne le basi biologiche e affrontare le sfide dell'infertilità. Tuttavia, i vincoli etici pongono limiti significativi nella raccolta di campioni di embrioni clinici umani, ostacolando la ricerca sulle intricate interazioni tra embrioni umani ed endometrio durante l'inizio della gravidanza^. Una profonda comprensione di questi complessi meccanismi è vitale per far progredire la ricerca biologica fondamentale, la scoperta di farmaci e la salute riproduttiva.

I precedenti modelli in vitro utilizzavano modelli di adesione in cui le cellule epiteliali endometriali umane monostrato (RL95-2)² venivano co-coltivate con sostituti embrionali, come le cellule di coriocarcinoma BeWo, JAr o Jeg-3³ . Tuttavia, la selezione delle dimensioni degli sferoidi, che vanno da 70 a 100 μm, è stata cruciale in quanto aggregati cellulari più grandi o più piccoli potrebbero compromettere l'accuratezza dell'esperimento. In particolare, solo il 25% degli sferoidi in ogni preparazione soddisfaceva lo standard per^{la dimensione 4} adatta e c'erano differenze significative rispetto alle condizioni fisiologiche delle blastocisti.

Inoltre, i sistemi di coltura tridimensionali (3D) per l'endometrio e la blastocisti offrono un ambiente fisiologicamente più rilevante⁵, ma richiedono elevate competenze tecniche, crescita cellulare lenta, elevati costi di risorse e manutenzione, difficoltà di standardizzazione e bassa riproducibilità⁶.

In questo protocollo, presentiamo un modello in vitro economico e rapido di impianto embrionale che può essere sviluppato e utilizzato nella maggior parte dei laboratori. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire una piattaforma affidabile e riproducibile per studiare le interazioni tra embrioni ed endometrio in un ambiente controllato. Simulando gli eventi chiave dell'impianto dell'embrione in vitro, questo modello mira a colmare il divario tra i modelli animali e i contesti clinici, consentendo una ricerca più precisa e mirata.

Rispetto ai sostituti embrionali, l'uso di blastocisti di topo offre una rappresentazione fisiologicamente più rilevante del processo di impianto dell'embrione in vivo⁷. Inoltre, la linea cellulare di Ishikawa, derivata dall'adenocarcinoma endometriale umano, possiede caratteristiche miste dell'epitelio ghiandolare e dell'epitelio del lume uterino¹, che le consentono di esprimere enzimi, proteine strutturali e recettori steroidei funzionali simili a quelli che si trovano nell'endometrio normale, fornendo così un substrato fisiologicamente rilevante per l'impianto dell'embrione. La semplicità e la rapidità del sistema di co-coltura consentono screening e test antidroga ad alto rendimento ^8,9,10. Fornendo una piattaforma robusta e riproducibile, questo metodo offre l'opportunità di far progredire la nostra comprensione dell'impianto dell'embrione e del suo impatto sulla salute umana.

Protocollo

La manipolazione dei topi e gli studi sperimentali sono stati eseguiti secondo i protocolli approvati dal Comitato per gli animali dell'Istituto di Shanghai per le tecnologie biomediche e farmaceutiche. Garantire le procedure di sicurezza: Indossare sempre dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati quando si maneggiano prodotti chimici o materiali biologici.

1. Acquisizione di embrioni di topo

NOTA: Questa sezione descrive il processo per ottenere embrioni di topo. Topi femmina adulta (6-8 settimane di età, ibridi C57BL/6 e DBA/2) sono stati mantenuti in condizioni ambientali standard di 12 ore di luce e 12 ore di buio a 20-25 °C e 40-60% di umidità con cibo e acqua forniti ad libitum.

1. Iniettare topi femmina per via intraperitoneale con 10 UI di gonadotropina sierica di cavalla gravida (PMSG) e poi, iniettare 10 UI di gonadotropina corionica umana (HCG) a un intervallo di 42-48 ore.
2. Accoppia ogni topo femmina con un maschio di età comparabile e controlla se c'è un tappo vaginale la mattina successiva.
   NOTA: Il tappo vaginale è un grumo giallo chiaro di supposta che si forma dopo che lo sperma si è solidificato all'apertura vaginale.
3. Eutanasia delle tope femmine con tappi vaginali per inalazione di CO₂ .
4. Aprire l'addome e localizzare i genitali femminili; allungare l'ovidotto, l'ovaio e i cuscinetti adiposi con una pinza; tagliare l'ovidotto e l'ovaio con le forbici; e poi, tagliare l'ovidotto e l'utero (Figura 1).
5. Trasferire l'ovidotto ottenuto in una piastra di Petri da 35 mm preriempita con terreno M2.
   NOTA: Il mezzo M2 deve essere preriscaldato in un'incubatrice (37 °C, 5% CO₂) per 30 minuti.
6. Perforare l'ampolla allargata dell'ovidotto con un ago da 25 G per rilasciare o pizzicare il complesso cumulo-zigote (Figura 2).
7. Utilizzare una pinza per trasferire il complesso cumulo-zigote in una soluzione M2 contenente 0,5 mg/mL di ialuronidasi e incubare per diversi minuti fino a quando le cellule del cumulo non si dissociano (Figura 3).
8. Raccogliere gli zigoti utilizzando una pipetta per il trasferimento degli ovuli e lavarli in un terreno M2 contenente 4 mg/mL di BSA per rimuovere la ialuronidasi residua, le cellule del cumulo e le impurità.

2. Coltura in vitro di embrione di topo

NOTA: Questa sezione descrive in dettaglio il processo di coltura in vitro di embrioni di topo da zigoti a blastocisti. Le microgocce di coltura KSOM devono essere preparate 24 ore prima per garantire l'equilibrio della temperatura e dei gas.

1. Preparare 12 microgoccioline di terreno KSOM, ciascuna con un volume di 20 μl, sul fondo di una piastra di Petri da 35 mm. Coprire le microgoccioline con 3-5 mL di olio minerale (Figura 4) e porre le piastre di Petri in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂ per l'equilibratura.
2. Trasferire gli embrioni di topo dal terreno M2 al terreno KSOM utilizzando una pipetta di trasferimento per un lavaggio accurato.
   NOTA: Questo passaggio richiede uno stereomicroscopio con un tavolino di riscaldamento a 37 °C. Ridurre al minimo la durata della manipolazione degli embrioni al di fuori dell'incubatrice.
3. Mettere gli embrioni lavati nelle microgoccioline KSOM preparate e incubarli a 37 °C con il 5% di CO₂ per 4 giorni.
   NOTA: Per garantire un'alimentazione adeguata, coltivare 5-10 embrioni per microgoccia da 20 μl.
4. Selezionare le blastocisti vantaggiose in base alle loro dimensioni (100-130 μm), alla massa cellulare interna (la massa cellulare interna è composta da molte cellule tutte compattate), al numero di cellule del trofoblasto (il trofoectoderma è composto da molte cellule coese e impacchettate insieme) e al grado di espansione (il blastocele occupa l'80-100% dell'embrione).

3. Preparazione delle cellule endometriali

1. All'interno di una cappa di biosicurezza, aspirare 1 mL di gelatina al 2% utilizzando una pipetta ed erogarla in una piastra di coltura a 12 pozzetti. Ruotare delicatamente la piastra per garantire la copertura completa del fondo con la gelatina. Mettere la piastra in un'incubatrice a 37 °C per 30 minuti. Successivamente, aspirare la gelatina in eccesso e lasciare asciugare completamente il fondo del piatto.
2. Al termine del processo di rivestimento, coltivare cellule di adenocarcinoma endometriale umano (Ishikawa) con DMEM/F12 (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli), 1 mM di piruvato di sodio, 2 mM di L-glutammina, 100 μg/mL di streptomicina e 100 UI/mL di penicillina, seminarle nelle piastre a 12 pozzetti rivestite di gelatina (2 × 10⁵cellule/pozzetto) e incubare per 24 ore.

4. Attaccamento all'embrione

1. Posizionare delicatamente 5-15 blastocisti fresche in ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti contenente le cellule di Ishikawa preparate nella fase precedente per la co-coltura (Figura 5).
2. Dopo 48 ore di incubazione, osservare gli embrioni al microscopio per valutare il loro stato di attaccamento. Per osservare l'attaccamento dell'embrione, spostare rapidamente la piastra tre volte. Gli embrioni non attaccati mostreranno un movimento fluttuante o rotolante sulla superficie delle cellule di Ishikawa.
3. Calcolare il tasso di impianto dell'embrione utilizzando l'equazione (1); Utilizzare il tasso di adesione dell'embrione per rappresentare l'effetto dell'impianto.
   Tasso di Impianto degli Embrioni = (Embrioni Attaccati/Numero Totale di Embrioni Impiantati) × 100% (1)

Risultati

Nel processo delle tecniche di riproduzione assistita, l'iperstimolazione ovarica controllata (COH) è un passaggio cruciale, che porta a livelli di estrogeni significativamente elevati nelle pazienti di oltre 10-20 volte rispetto ai cicli naturali¹¹. Dato questo contesto, ci siamo chiesti se alte concentrazioni sieriche di estrogeni influiscano sull'impianto dell'embrione durante il trasferimento di embrioni freschi. Sulla base di questo modello di impianto embrionale, abbiamo studiato gli effett...

Discussione

La semplicità e la rapidità del modello in vitro proposto per l'impianto dell'embrione offrono notevoli vantaggi per lo screening farmacologico in fase iniziale e altre applicazioni di ricerca. Il protocollo semplice, unito alla natura ad alto rendimento delle linee cellulari Ishikawa, lo rende un candidato ideale per screening su larga scala, in particolare nelle prime fasi della scoperta di farmaci. Liang¹³ ha scoperto che il knockdown di TAGLN2 diminuisce la capacità di invasione de...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
17-β-estradiol	SIGMA	3301	Most potent mammalian estrogenic hormone
BD Falcon	BD	353001	Bacteriological Petri Dishes 35 x 10 mm style w/tight lid, crystal-grade virgin polystyrene, sterile
Biosafety Cabinet	ESCO	class BSC	Aseptic operations, making culture dishes, aliquoting reagents, etc
CO2 Incubator	Thermo	8000DH	Embryo culture
Culture plate	Corning	3506	Cell culture
DMEM/F12	Gibco	1133032	DMEM/F12 (1x), liquid 1:1,Contains L-glutamine and 15 mM HEPES buffer
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141	Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin
Gelatin	SIGMA	G9391	Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
HCG	Nanjing Aibei	M2520	Sterilization reagent, intraperitoneal injection, 50 IU/mL
Hyaluronidase	SIGMA	V900833	Reagent grade, powder
KSOM	Merck	MR-020P-D	(1x), Powder, w/o Phenol Red, 5 x 10 mL
L-glutamine	Gibco	25030081	L-glutamine-200 mM (100x), liquid
M2	Merck	MR-015-D	EmbryoMax M2 Medium (1x), Liquid, with Phenol Red
Mineral oil	SIGMA	M8410	Mineral oil is suitable for use as a cover layer to control evaporation and cross-contamination in various molecular biology applications
Penicillin-Streptomycin, liquid	Gibco	15140122	10,000 Units penicillin (base) and 10,000 units streptomycin (base), utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline
PMSG	Nanjing Aibei	M2620	Sterilization reagent ,intraperitoneal injection, 50 IU/mL
Progesterone	SIGMA	5341	Steroid hormone secreted by the corpus luteum during the latter half of the menstrual cycle
Sodium pyruvate	Gibco	11360070	Sodium pyruvate is commonly added to cell culture media as a carbon source in addition to glucose
Stereomicroscope	Olympus	SZX7	Embryo retrieval and observation of embryo development