Generazione e analisi di immagini istologiche ad alto parametro con la citometria a flusso istodinamico

Riepilogo

Qui descritto è un metodo che può essere utilizzato per visualizzare cinque o più parametri fluorescenti mediante microscopia immunofluorescente. Viene delineata una pipeline di analisi per estrarre singole cellule da queste immagini e condurre analisi di singole cellule attraverso strategie di gating simili alla citometria a flusso, in grado di identificare sottogruppi di cellule in sezioni di tessuto.

Abstract

L'uso dell'istologia per studiare la diversità delle cellule immunitarie in sezioni di tessuto, come quelle derivate dal sistema nervoso centrale (SNC), è limitato in modo critico dal numero di parametri fluorescenti che possono essere visualizzati contemporaneamente. La maggior parte dei sottogruppi di cellule immunitarie è stata definita utilizzando la citometria a flusso utilizzando combinazioni complesse di marcatori proteici, che spesso richiedono quattro o più parametri per essere identificati in modo definitivo, il che va oltre le capacità della maggior parte dei microscopi convenzionali. Poiché la citometria a flusso dissocia i tessuti e perde informazioni spaziali, sono necessarie tecniche in grado di conservare le informazioni spaziali mentre interrogano i ruoli dei tipi di cellule complesse. Questi problemi sono affrontati qui creando un metodo per espandere il numero di parametri fluorescenti che possono essere visualizzati raccogliendo i segnali dei fluorofori spettralmente sovrapposti e utilizzando l'unmixing spettrale per separare i segnali di ogni singolo fluoroforo. Queste immagini vengono quindi elaborate utilizzando una pipeline di analisi per acquisire immagini istologiche ad alto parametro ed estrarre singole cellule da queste immagini in modo che le proprietà fluorescenti uniche di ciascuna cellula possano essere analizzate a livello di singola cellula. Utilizzando strategie di gating simili alla citometria a flusso, le cellule possono quindi essere profilate in sottogruppi e mappate nuovamente sulle sezioni istologiche non solo per quantificare la loro abbondanza, ma anche per stabilire come interagiscono con l'ambiente tissutale. Nel complesso, è stata dimostrata la semplicità e il potenziale dell'utilizzo della citometria a flusso istologico per studiare popolazioni immunitarie complesse nelle sezioni istologiche.

Introduzione

L'infiammazione guidata dalle cellule del sistema immunitario e dalle cellule gliali può contribuire a disturbi cronici del SNC in cui ogni popolazione può promuovere l'attività dell'altra ^1,2,3. Capire come il sistema immunitario interagisce con questi elementi del SNC per promuovere l'infiammazione del SNC è attualmente un argomento di grande interesse ed è stato notevolmente facilitato da tecniche ad alto parametro come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Attraverso il sequenziamento dell'RNA a singola cellula, abbiamo scoperto che esiste un'ampia comunicazione t....

Protocollo

Questo protocollo non copre il sezionamento dei tessuti per l'istologia; si veda Jain et ^al.18 o¹⁹ per le descrizioni di come sezionare i tessuti per l'istologia. Questo protocollo può essere utilizzato con qualsiasi tessuto sezionato su vetrini. Questo articolo utilizza linfonodi inguinali isolati da un animale immunizzato come descritto in precedenza¹⁸. La procedura e la tempistica di questo protocollo sono riassunte nella Figura 1. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

Discussione

Qui viene descritto l'uso della citometria a istoflusso, una tecnica che è stata convalidata in precedenza¹⁸. È dimostrato che quando si colorano sezioni di tessuto con coloranti spettralmente sovrapposti, il sanguinamento attraverso i canali può essere rimosso utilizzando la compensazione spettrale, con conseguente risoluzione chiara di un numero maggiore di parametri fluorescenti rispetto a quanto sarebbe normalmente possibile con i metodi convenzionali. Poiché le immagini istologiche ad alt.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% Ethanol	Sigma	676829-1L
4% PFA	Electron Microscopy Sciences	157-4
Anaconda	N/A	N/A	https://www.anaconda.com/download
Bovine Serum Albumin	Sigma	A4503-50G
Cold fish stain gelatin	Sigma	G7765
Collating multichannel data from Imaris.ipynb script	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-
Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-
Donkey anti-rat Alexa Fluor 647	JacksonImmunoResearch	712-605-153	1:300 concentration
Donkey anti-rat DyLight 405	Jackson ImmunoResearch	712-475-153	1:200 concentration
Donkey Serum	JacksonImmunoResearch	017-000-001
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710	Thermofisher	46-4010-82	1:25 concentration
FIJI	N/A	N/A	https://imagej.net/software/fiji/
FlowJo	FlowJo LLC		Software 4
Fluorescence spectraviewer			https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Fresh frozen human tonsil sections	amsbio	HF-707
Glass coverslip	VWR	48393 106
Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488	JacksonImmunoResearch	109-546-011	1:400 concentration
Goat anti-human IgG Cy3	JacksonImmunoResearch	709-166-098	1:400 concentration
Goat anti-human IgM Dylight 405	JacksonImmunoResearch	109-476-129	1:300 concentration
Goat anti-rabbit A546	Thermo Fisher Scientific	A-11035	1:250 concentration
Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610	Thermofisher	A-20981	1:250 concentration
Horse Serum	Sigma	H1138
Ilastik	N/A	N/A	https://www.ilastik.org/
Ilastik FIJI plugin	N/A	N/A	https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin
Imaris File Converter	Oxford Instruments		Software 2
Imaris with cell module	Oxford Instruments		Software 3
kimwipe	Kimtech	34155
LasX Life Science software	Leica		Software 1
Mouse anti-human CD20	VWR	CA95024-322	1:40 concentration
Mouse anti-human CD38 APC-R700	BD Biosciences	564980	1:20 concentration
Normal Goat Serum	JacksonImmunoResearch	005-000-001
Normal Mouse Serum	JacksonImmunoResearch	015-000-001
Normal Rabbit Serum	JacksonImmunoResearch	011-000-001
Normal Rat Serum	JacksonImmunoResearch	012-000-120
Nuclear Yellow	Abcam	ab138903	Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark
PAP pen	Cedarlane	MU22
PBS	Gibco	10010-023
Rabbit anti-human Ki67	Abcam	ab15580	1:500 concentration
Rabbit anti-mouse Iba1	Wako	019-19741	1:500 concentration
Rat anti-human Blimp1	Thermofisher	14-5963-82	1:40 concentration
Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647	BioLegend	103226	1:250 concentration
Rat anti-mouse CD138	Biolegend	142502	1:200 concentration
Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610	Thermo Fisher Scientific	61-0032-82	1:40 concentration
Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488	BioLegend	100529	1:200 concentration
Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700	BD Biosciences	565478	1:50 concentration
Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710	Thermo Fisher Scientific	46-5993-82	1:50 concentration
SP8 Confocal microscope	Leica
Triton X-100	Sigma	X100-500ml
Trueblack	Biotium	23007
Tween-20	Sigma	P7949-500ml
Ultracomp ebeads	Thermofisher	01-2222-42