Studi sull'effetto antinfiammatorio delle pillole Xiaoyao nel trattamento dell'osteoporosi postmenopausale nei topi

Riepilogo

L'osteoporosi postmenopausale è diventata un problema di salute pubblica globale. Lo scopo di questo studio è quello di esplorare gli effetti terapeutici e i meccanismi correlati della medicina tradizionale cinese Xiaoyao pillole su questa condizione.

Abstract

L'osteoporosi è una malattia metabolica comune delle donne anziane e in postmenopausa, senza sintomi evidenti durante le sue fasi iniziali. Nelle ultime fasi di questa condizione, i pazienti sono soggetti a fratture e questo può compromettere seriamente la loro salute e la qualità della vita. L'aumento dell'aspettativa di vita in tutto il mondo ha reso l'osteoporosi una preoccupazione globale. Le pillole Xiaoyao erano precedentemente
Utilizzato nel trattamento della depressione. Inoltre, il farmaco sembrava avere un'attività estrogeno-simile, che influenzava l'espressione di ALP, un marcatore specifico precoce per gli osteoblasti, e COL-1, un componente importante della matrice extracellulare ossea. Le pillole Xiaoyao sono state valutate per i loro effetti sull'osteoporosi postmenopausale (PMOM) nei topi. Le informazioni sul bersaglio di ciascun componente erboristico delle pillole Xiaoyao sono state accessibili attraverso il database Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology (TCMSP). Le informazioni provenienti da GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD, DrugBank e altri siti Web sono state utilizzate per costruire la rete regolatoria del complesso erboristico attraverso la rete Cytoscape e String per valutare le interazioni proteiche. I topi sono stati ovariectomizzati e trattati con dosi alte e basse di pillole Xiaoyao e queste sono state confrontate con i controlli. I loro sintomi sono stati valutati mediante immunocitochimica dei tessuti ossei. I risultati hanno suggerito che le pillole Xiaoyao avevano la capacità di alleviare i sintomi della PMOM nei topi ovariectomizzati attraverso la via di segnalazione IL-17. Questo farmaco ha il potenziale per diventare un nuovo agente terapeutico per il trattamento dell'osteoporosi.

Introduzione

L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) definisce l'osteoporosi (OP) come una malattia caratterizzata da una diminuzione della massa ossea e dal deterioramento della microarchitettura del tessuto osseo, che porta ad un aumento della fragilità ossea e, quindi, ad un aumento del rischio di frattura¹. Il significato clinico dell'osteoporosi è che può portare a fratture, che sono associate a un'elevata mortalità, morbilità e costi economici². L'osteoporosi postmenopausale (PMOP) è causata da una diminuzione dei livelli di estrogeni nelle donne dopo la menopausa, che porta ad un aumento dell'attività degli osteoclasti, con conseguente perdita ossea e distruzione della microstruttura ossea. Questo spesso causa l'osteoporosi con un grave impatto sulla salute³. Le attuali terapie per la PMOP includono la terapia sostitutiva con estrogeni, i bifosfonati e l'ormone paratiroideo, ma possono avere vari gradi di effetti avversi, una compliance insufficiente a lungo termine e costi elevati⁴. Pertanto, la fitoterapia a prezzi accessibili è una valida alternativa per gran parte della popolazione.

Le pillole di Xiaoyao sono incluse nella Farmacopea^{cinese 5} e contengono otto componenti erboristici, tra cui Chai Hu, Angelica sinensis, Paeonia lactiflora bianca, Atractylodes macrocephala, Poria cocos, Menthae Herba, liquirizia e zenzero fresco. Tutte queste erbe sono note per essere efficaci nella disintossicazione del fegato e nel rafforzamento della milza, nel nutrimento del sangue e nella regolazione del ciclo mestruale, e la miscela è stata utilizzata anche per il trattamento della depressione⁶. Tuttavia, il ruolo delle pillole Xiaoyao nell'osteoporosi non è chiaro.

I primi studi hanno suggerito che l'infiammazione può portare alla perdita ossea⁷ e che il declino della densità ossea associato a questo processo può essere accelerato dalla menopausa. Inoltre, esiste una forte relazione tra lo sviluppo dell'osteoporosi e l'infiammazione. Il fattore infiammatorio, l'interleuchina-17 (IL-17), è un fattore pro-infiammatorio secreto dalle cellule Th17, un sottogruppo di linfociti T CD4+. Queste cellule sono associate a diverse condizioni infiammatorie croniche e svolgono un ruolo importante nello sviluppo della distruzione ossea nell'artrite reumatoide⁸. Inoltre, l'IL-17 stimola l'attivatore del recettore del ligando del fattore nucleare κ B (RANKL), che regola l'osteoclastogenesi, portando a un maggiore riassorbimento osseo rispetto alla formazione ossea⁹. L'IL-17 stimola l'espressione di altre citochine osteoclastogeniche come TNFα, IL-1, IL-6 e IL-8. Ha la capacità di sinergizzare con altri fattori infiammatori, rendendolo un importante effettore infiammatorio¹⁰.

Gli studi hanno anche dimostrato un legame tra le pillole Xiaoyao e l'infiammazione. Shi et ^al.11 e Fang et ^al.12 hanno recentemente confermato che le pillole Xiaoyao possono ridurre i livelli di IL-6 e TNF-α, rispettivamente. In un altro studio sulla steatoepatite associata al metabolismo, è stato riportato che le pillole di Xiaoyao potrebbero sovraregolare l'espressione dell'acido propionico, che a sua volta inibisce l'espressione del TNF-α ed esercita un effetto antinfiammatorio¹³. Tuttavia, al momento, non è noto se le pillole Xiaoyao possano regolare lo sviluppo della PMOM mediando una risposta infiammatoria attraverso IL-17, che era lo scopo di questo studio.

Questo studio ha previsto l'intersezione dei bersagli delle pillole Xiaoyao e dei geni correlati all'osteoporosi attraverso la farmacologia di rete e l'analisi bioinformatica e ha analizzato i geni intersecanti per le interazioni proteiche, GO e KEGG. Sulla base dei risultati attesi, l'espressione di Act1 e IL-6, che sono proteine chiave nella via di segnalazione di IL-17, può essere osservata^14,15, così come i marcatori di turnover osseo fosfatasi alcalina (ALP) e collagene di tipo I (COL-1), per osservare l'efficacia terapeutica delle pillole Xiaoyao nel modello murino PMOM.

Protocollo

Il Comitato Etico per gli Animali da Laboratorio dell'Università di Medicina di Youjiang per le Nazionalità ha approvato il protocollo di studio (numero di approvazione: 2022101502). I topi femmina C57BL/6, di età compresa tra 10 e 12 settimane, classe SPF e peso corporeo (22 ± 2) g, sono stati ospitati nel Centro di sperimentazione animale di classe SPF dell'Università medica di Youjiang per le nazionalità. Gli animali da esperimento sono stati mantenuti a una temperatura di 24-26 °C e un'umidità relativa compresa tra il 55% e il 60%.

1. Database di farmacologia dei sistemi di medicina tradizionale cinese e piattaforma di analisi

NOTA: Il database e la piattaforma di analisi farmacologica dei sistemi di medicina tradizionale cinese (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) sono piattaforme di farmacologia della medicina cinese che contengono informazioni sugli ingredienti della MTC, sulle proprietà correlate all'ADME, sui bersagli e sulle malattie^16,17.

1. Accedi all'interfaccia web del TCMSP. Cerca il nome di Herb, inserisci il nome della medicina cinese e fai clic su Cerca. Fare clic su Nome latino nei risultati della ricerca. Eseguire lo screening sui risultati degli ingredienti con i parametri OB ≥ 30% e DL ≥ 0,18.
2. Copia tutti i risultati e salvali in formato TXT, chiamato Medicina Cinese Name_ingredients.txt.
3. In Informazioni sulle destinazioni nella scheda Destinazioni correlate, filtrare per l'ID Mol (ad esempio, il risultato del passaggio 1.2).
4. Copia i risultati filtrati e salvali in formato TXT denominato Chinese Medicine Name_targets.txt.
   NOTA: Attraverso i passaggi precedenti, sono stati ottenuti tutti i principi attivi idonei e le corrispondenti informazioni target della medicina tradizionale cinese (MTC).
5. Posiziona tutti i file ingredients.txt di cui sopra e i file targets.txt nella stessa cartella e posiziona gli script Perl (Supplementary Coding File 1) in quella cartella.
6. Apri CMD, digita il percorso della cartella cd, inseriscilo ed esegui lo script Perl. Ottenere un nuovo file di testo (allTargets.txt). Questo nuovo file di testo (allTargets.txt) contiene il nome dell'erbe, il nome dell'ingrediente, l'ID dell'ingrediente e il bersaglio.

2. Banca dati UniProt

NOTA: Il database UniProt (https://www.uniprot.org/) contiene sequenze proteiche umane annotate con informazioni funzionali e viene utilizzato per normalizzare i nomi dei bersagli con i loro nomi ufficiali¹⁸.

1. Vai all'interfaccia web di UniProt. Fare clic sulla scheda Cerca , selezionare UniProtKB e fare clic su Cerca.
2. Filtra nella barra laterale sinistra, seleziona Recensito (Swiss-Prot) per Stato e Umano per Organismi popolari. Fare clic su Download, selezionare Scarica tutto, selezionare TSV per Formato e fare clic su Download per scaricare il file di annotazione.
3. Decomprimi il file scaricato nella cartella corrente, apri il file decompresso e copialo e incollalo in un file di testo denominato ann.txt.

3. Conversione dell'ID del bersaglio del farmaco

1. Metti tutti i file di bersaglio del farmaco allTargets.txt ottenuti nella sezione 1 e il file di annotazione UniProt ann.txt ottenuto nella sezione 2 in una cartella e inserisci gli script Perl (Supplementary Coding File 2) al suo interno.
2. Apri CMD, digita cd + spazio + percorso cartella, inseriscilo ed esegui lo script Perl per ottenere un nuovo file di testo (allTargets.symbol.txt). Questo nuovo file di testo (allTargets.symbol.txt) contiene il nome dell'erbe, l'ID dell'ingrediente, il nome dell'ingrediente e l'ID del gene.

4. Ricerca nel database

1. GeneCards: database di geni umani (GeneCards)
   NOTA: Il database GeneCards (https://www.genecards.org/) fornisce informazioni di previsione e annotazione per i geni umani. Viene utilizzato per accedere ai bersagli della malattia^19,20.
   1. Vai all'interfaccia web di GeneCard. Digita osteoporosi nella casella di ricerca e fai clic su Cerca.
   2. Fare clic su Esporta e selezionare Esporta in Excel.
   3. Apri il file scaricato, copia i geni con il punteggio di pertinenza ≥ 1, incollali e salvali in un file chiamato GeneCards.txt.
2. Banca dati OMIM
   NOTA: Il database OMIM (https://omim.org) contiene geni, malattie genetiche e tratti umani²¹.
   1. Vai all'interfaccia web di OMIM. Fai clic su GENE Map, digita osteoporosi nella casella di ricerca e fai clic su Cerca.
   2. Fare clic su Scarica con nome e selezionare File Excel.
   3. Apri il file scaricato, copia il nome del gene nella colonna Simbolo approvato, incollalo e salvalo in un file chiamato OMIM.txt.
3. Banca dati PharmGkb
   NOTA: PharmGkb (https://www.pharmgkb.org), la base di conoscenze di farmacogenomica, contiene annotazioni sull'etichetta dei farmaci, percorsi incentrati sui farmaci, riassunti farmacogenetici e relazioni tra geni, farmaci e malattie²².
   1. Vai all'interfaccia del sito web di PharmGkb. Inserisci osteoporosi nella casella di ricerca, fai clic su Cerca e seleziona Gene nella barra laterale sinistra.
   2. Inserisci manualmente tutti i risultati e salvali in un file chiamato PharmGkb.txt.
4. TTD: database dei bersagli terapeutici (TTD)
   NOTA: Il database TTD (https://idrblab.org/ttd/) fornisce informazioni sui bersagli di proteine e acidi nucleici, sulle malattie mirate, sulle informazioni sul percorso e sui farmaci corrispondenti per ciascun bersaglio²³.
   1. Vai all'interfaccia web di TTD. Digita osteoporosi nella casella di ricerca e fai clic su Cerca.
   2. Fare clic su Informazioni di destinazione in ID di destinazione nel risultato, copiare il nome di destinazione, incollarlo e salvarlo in un file denominato TTD.txt. Sono stati ottenuti un totale di 33 risultati. Salva ogni risultato allo stesso modo.
5. Banca dati DrugBank Online (DrugBank)
   NOTA: Il database DrugBank (https://go.drugbank.com) contiene informazioni sui farmaci e sui bersagli farmacologici, sulle interazioni farmacologiche, sui meccanismi farmacologici e sul metabolismo dei farmaci²⁴.
   1. Vai all'interfaccia del sito web di DrugBank. Seleziona Indicazioni nella scheda di ricerca, digita osteoporosi nella casella di ricerca e fai clic su Cerca.
   2. Clicca sulla voce Osteoporosi nei risultati per maggiori informazioni, clicca sulla scheda FARMACI E BERSAGLI e clicca sul Link Appropriato nella colonna TARGET della tabella.
   3. Fare clic su Dettagli in Proteina, copiare il nome del gene, incollarlo e salvarlo in un file denominato DrugBank.txt. Salva ogni risultato allo stesso modo.

5. Diagramma di Venn

1. Fusione genica associata alla malattia e mappatura di Venn
   1. Metti i file txt salvati e lo script nella stessa cartella.
   2. Apri il codice R (Merge Disease-Related Genes), copia e incolla il percorso in cui è memorizzato il file txt di cui sopra nella riga in cui si trova il setwd nel codice R.
   3. Apri il software R, esegui il codice R modificato e salva. Imposta il gene, assegna un nome al file Disease.txt.
   4. Apri il sito web di Draw Venn Diagram; nella sezione di input, copia e incolla il contenuto di testo salvato nelle sezioni da 4 a 8 uno per uno nell'elenco, denominandolo con il rispettivo database e facendo clic su Invia.
   5. Fai clic su Salva immagine come PNG sotto l'immagine e salva il risultato del testo nella stessa cartella.
2. Intersezione di bersagli farmacologici e geni associati alla malattia
   1. Inserire il file allTargets.symbol.txt ottenuto nella sezione 3 e il file Disease.txt ottenuto nel passaggio 5.1.3 nella stessa cartella.
   2. Apri il codice R (l'intersezione tra il bersaglio del farmaco e il gene correlato alla malattia), copia e incolla il percorso in cui è memorizzato il file txt di cui sopra nella riga in cui si trova il setwd nel codice R.
   3. Apri il software R, esegui il codice R modificato e salva. Imposta il gene, assegna un nome al file Drug_Disease.txt.
   4. Apri il sito web Disegna diagramma di Venn. Nella sezione di input, copia e incolla allTargets.symbol.txt e Disease.txt nell'elenco e denominali con i nomi dei rispettivi file.
   5. Fai clic su Salva immagine come PNG sotto l'immagine e salva i risultati del testo nella stessa cartella.

6. Costruzione della rete regolatoria del TCM compounding

1. Collocare il file allTargets.symbol.txt ottenuto nella sezione 3 nella stessa cartella del file Disease.txt e dello script Perl corrispondente (Supplementary Coding File 3).
2. Apri CMD, digita il percorso del file cd, premi Invio ed esegui lo script Perl. Ottieni quattro nuovi file txt: net.geneLists.txt, net.molLists.txt, net.network.txt e net.type.txt. Il file network.txt contiene l'ID dell'ingrediente TCM, il gene target, la relazione target e il nome dell'ingrediente. net.type.txt contiene il nome del nodo, gli attributi e l'affiliazione. net.geneLists.txt è l'elenco dei geni e net.molLists.txt è l'elenco degli ingredienti.
3. Copia i file di testo appena ottenuti nella stessa nuova cartella.
4. Apri il software Cytoscape 3.9.1, fai clic su File, fai clic su Importa e seleziona File modulo di rete. Selezionare net.network.txt, inserire la prima colonna di ID componente come nodo di origine, la seconda colonna di Geni come nodo di destinazione e la terza colonna di Relazione di targeting come tipo di interazione e fare clic su OK.
5. Importare net.type.txt dalla finestra Tabella nodi. Fare clic sulla scheda Seleziona, selezionare Nodi, selezionare Da file elenco ID, selezionare net.geneLists.txt e fare clic su Apri.
6. Fare clic sulla scheda Layout, selezionare Layout cerchio ordinato in gradi e selezionare Solo nodi selezionati. Regola sia l'altezza che la larghezza dei nodi su 70.
7. Fare clic sulla seconda casella in Altezza, selezionare degree.layout in Colonna, selezionare Mappatura continua in Tipo di mappatura e fare doppio clic sulla finestra di regolazione dell'altezza sul lato destro della mappatura corrente per regolare i limiti superiore e inferiore dell'altezza in un intervallo appropriato.
8. Ripetere l'operazione con l'opzione Larghezza.
9. Fare nuovamente clic sulla scheda Layout , quindi su Strumenti di layout > Regola la scala in modo che i nodi non si sovrappongano.
10. Fare clic sulla finestra in alto a destra del software per deselezionare la rete di nodi, fare clic sulla scheda Seleziona , selezionare Nodi, selezionare Da file elenco ID, selezionare net.molLists.txt e fare clic su Apri.
11. Fare clic sulla scheda Layout, selezionare Layout attributi gruppo, selezionare Solo nodi selezionati e fare clic su Tipo.
12. Fai clic su Dimensione carattere etichetta nella colonna di sinistra e imposta Valore predefinito su 12. Fare clic su Valore predefinito nell'immagine/grafico 1 nella colonna di sinistra.
13. Seleziona Grafici nella finestra popup, fai clic su Grafico a torta e seleziona gli elementi nella colonna Colonne disponibili ad eccezione del grado. Layout nella colonna delle colonne selezionate e fare clic su Applica.
14. Fare clic su Border Paint nella colonna di sinistra e impostare il valore predefinito su #003EF8. Fai clic sulla scheda Bordo nella parte inferiore della barra laterale sinistra e imposta Larghezza su 0,8.
15. Fai clic su File nella barra degli strumenti in alto, seleziona Esporta, quindi seleziona Da rete a immagine.
16. Nella finestra pop-up, selezionare Formato PNG per Formato, selezionare la directory di salvataggio e assegnare un nome alla rete di immagini, regolare lo zoom nella dimensione dell'immagine al massimo del 500%, selezionare Sfondo trasparente e fare clic su OK per completare il salvataggio dell'immagine.

7. Costrutti di reti di interazione proteina-proteina (PPI)

1. Aprire il sito Web STRING (https://string-db.org/), fare clic su Proteine multiple, fare clic su Sfoglia in Carica un file, selezionare il file Drug_Disease.txt ottenuto nel passaggio 5.2.3 e selezionare Homo sapiens in Organismi. Fai clic su Cerca e fai clic su Continua.
2. Fare clic su Impostazioni, impostare il punteggio minimo di interazione richiesto sull'attendibilità massima (0,900) e selezionare Nascondi nodi disconnessi nella rete nelle opzioni di visualizzazione della rete. Fare clic su Aggiorna.
3. Apportare modifiche ai nodi nel diagramma di rete in modo che non vi siano sovrapposizioni o occlusioni.
4. Fare clic su Esportazioni , quindi su Scarica come bitmap ad alta risoluzione per ottenere la mappa della rete di interworking delle proteine in formato PNG. Inoltre, scarica il file TSV come breve output di testo tabulare. Salva entrambi i file in una cartella unificata. Il file TSV contiene il nome del gene, l'ID interno STRING e i punteggi per diversi attributi.

8. Costruzione del nucleo di rete PPI

1. Inserire il file TSV ottenuto nella sezione 7 e gli script Perl richiesti in una nuova cartella.
2. Aprire il software Cytoscape 3.9.1, fare clic su File, selezionare Importa, fare clic su Rete da file, selezionare il file TSV sopra, inserire la prima colonna node1 come nodo di origine e la seconda colonna node2 come nodo di destinazione e fare clic su OK.
3. Fai clic su Stile nella barra laterale sinistra, fai clic su Valore predefinito in Larghezza e impostalo su 60. Trascina e rilascia i nodi in modo che non ci siano sovrapposizioni e occlusioni nella rete.
4. Fare clic su APP nella barra degli strumenti superiore, fare clic su CytoNCA e fare clic su Apri.
5. Nella colonna di sinistra, selezionare Senza peso in Tramezzo, Vicinanza, Grado, Autovettore, Metodo basato sulla connettività media locale e Rete, quindi fare clic su Analizza.
6. Al termine dell'analisi, fare clic su Tabella nodi nella finestra in basso a destra, fare clic su Esporta, salvarla nella cartella e denominarla con punteggio 1.
   NOTA: Il plugin CytoNCA deve essere installato nel software Cytoscape. A tale scopo, fare clic su App nella barra degli strumenti in alto, fare clic su APP Manager, immettere CytoNCA nella casella di ricerca, selezionare CytoNCA nella colonna centrale dei risultati restituiti e fare clic su Installa.
7. Apri score1, regola la colonna del nome sulla prima colonna, copia le informazioni nella tabella, incollale in un nuovo file di testo, denominale score1.txt e salvale.
8. Apri il codice R e copia e incolla il percorso in cui si trova il file score1.txt fino alla riga in cui si trova setwd nel codice R.
9. Apri il software R ed esegui il codice modificato per ottenere due nuovi file, score2.txt e score2.gene.txt. Il file score2.txt contiene i geni per i quali tutti i punteggi dei programmi sono stati maggiori della mediana e i punteggi specifici per ciascun programma. score2.gene.txt contiene i geni che hanno ottenuto un punteggio maggiore della mediana per tutti gli elementi.
10. Per continuare con Cytoscape, fare clic su AnalysisPanel 1 nella finestra in basso a destra, fare clic su Carica da file sul lato sinistro della finestra, selezionare la score2.gene.txt, fare clic su Apri e toccare OK nella finestra pop-up.
11. Fare clic su Seleziona nodi in basso e fare clic su OK nella finestra pop-up.
12. Fai clic su File nella barra degli strumenti in alto, seleziona Esporta, fai clic su Rete su immagine, regola lo zoom (%) in Dimensione immagine al massimo del 500%, seleziona Sfondo trasparente e salva il file nella stessa cartella, chiamalo rete1.
13. Fai clic su Crea sottorete nella barra laterale destra della finestra inferiore per creare una sottorete, analizza la sottorete, fai clic su APP nella barra degli strumenti in alto, fai clic su CytoNCA e fai clic su Apri.
14. Nella barra laterale sinistra, seleziona Senza peso in Tramezzo, Vicinanza, Grado, Autovettore, Metodo basato sulla connettività media locale e Rete, quindi fai clic su Analizza.
15. Al termine dell'analisi, fare clic su Tabella nodi nella finestra in basso a destra, fare clic su Esporta e salvarla in una nuova cartella denominata score2.
16. Apri score2, regola la colonna del nome sulla prima colonna, copia le informazioni nella tabella, incollale in un nuovo file di testo, denominale score2.txt e salvale.
17. Apri il codice R e copia e incolla il percorso in cui si trova il file score2.txt nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
18. Apri il software R ed esegui il codice modificato per ottenere due nuovi file: score3.txt e score3.gene.txt. Il file score3.txt contiene i geni che hanno ottenuto un punteggio maggiore della mediana per tutti gli elementi e i punteggi specifici per ciascun elemento. score3.gene.txt contiene i geni che hanno ottenuto un punteggio maggiore della mediana per tutti gli elementi.
19. Per continuare con Cytoscape, fare clic su AnalysisPanel 1 nella finestra in basso a destra, fare clic su Carica da file sul lato sinistro della finestra, selezionare il score3.gene.txt, fare clic su Apri e toccare OK nella finestra pop-up.
20. Fare clic su Seleziona nodi in basso e fare clic su OK nella finestra pop-up.
21. Fai clic su File nella barra degli strumenti in alto, seleziona Esporta, fai clic su Rete su immagine, regola Zoom (%) in Dimensione immagine su 500%, seleziona Sfondo trasparente e salva il file nella stessa cartella utilizzata in questo passaggio, denominandolo rete2.
22. Fai clic su Crea sottorete nella barra laterale destra della finestra sottostante per creare una sottorete.
23. Fai clic su File nella barra degli strumenti in alto, seleziona Esporta, fai clic su Da rete a immagine, regola lo zoom (%) in Dimensione immagine fino a un massimo del 500%, seleziona Sfondo trasparente e salva il file nella stessa cartella utilizzata in questo passaggio e chiamalo network3.

9. Conversione dell'ID genico

1. Inserire il file Drug_Disease.txt nella stessa nuova cartella del file di codice richiesto.
2. Apri il codice R (Supplementary Coding File 4) e copia e incolla il percorso in cui si trova il file Drug_Disease.txt alla riga in cui si trova setwd nel codice R.
3. Apri il software R, esegui il codice modificato utilizzando l'org. Hs.eg.db pacchetto per convertire l'ID del gene ed eseguirlo dopo il completamento di un nuovo file id.txt. Il id.txt contiene il simbolo del gene e l'ID corrispondente.

10. Analisi dell'arricchimento GO

1. Inserire il file id.txt del passaggio precedente nella stessa cartella del codice di analisi dell'arricchimento GO.
2. Aprire il codice R (Supplementary Coding File 5) e impostare la directory di lavoro su id.txt e il percorso in cui è memorizzato il codice GO.
3. Aprire il software R, eseguire il codice modificato e usare clusterProfiler, org. Hs.eg.db, arricchisci il grafico, il grafico ggplot2, gli istogrammi dell'analisi dell'arricchimento GO e i grafici a bolle. Al termine dell'esecuzione, ottenere tre nuovi file, GO.txt, barplot.pdf e bubble.pdf.
   NOTA: Il GO.txt è il file dei risultati dell'arricchimento contenente la classificazione dell'arricchimento (BP, CC, MF), GO ID, Go nome, proporzione del gene, proporzione di fondo, significato dell'arricchimento p-value, p-value corretto (p.adjust, valore), gene ID (nome) e numero di geni arricchiti su ciascun GO. barplot.pdf è l'istogramma, la bolla. Il PDF è un grafico a bolle.

11. Analisi dell'arricchimento KEGG

1. Inserire il file id.txt nella stessa cartella del codice di analisi dell'arricchimento KEGG.
2. Aprire il codice R (Supplementary Coding File 6) e impostare la directory di lavoro sul percorso in cui sono memorizzati id.txt e il codice KEGG.
3. Aprire il software R, eseguire il codice modificato e usare clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichplot, pacchetto ggplot2 per tracciare istogrammi di analisi dell'arricchimento GO, grafici a bolle e grafici di percorso. La corsa si completa con la produzione di tre nuovi file, KEGG.txt, barplot.pdf e bubble.pdf.
   NOTA: Il file KEGG.txt è un file dei risultati dell'arricchimento contenente l'ID del percorso, la descrizione del percorso, la proporzione genica, la proporzione di fondo, il valore p del significato dell'arricchimento, il valore p corretto (p.adjust, qvalue), l'ID del gene (nome) e il numero di geni arricchiti in ciascun percorso. barplot.pdf è un grafico a barre e bubble.pdf è un grafico a bolle.
4. Cerca IL-17 nel file KEGG.txt; Il risultato mostra che esiste un solo percorso; copiare l'ID del percorso.
5. Aprire il codice R, incollare l'ID del percorso IL-17 in KEGGID e usare il pacchetto pathview per etichettare la mappa del percorso. Eseguire il codice R modificato e ottenere due nuovi file, hsa04657.pathview.png e hsa04657.png.
   NOTA: Il file hsa04657.png è la mappa del percorso, hsa04657.pathview.png è la mappa del percorso etichettato e quelli etichettati in rosso sono i geni presenti nella rete di interazioni.

12. Preparazione delle pillole Xiaoyao

NOTA: Per il metodo di preparazione utilizzato, fare riferimento alla Farmacopea cinese⁵.

1. Assumere 100 g di Chai Hu, 100 g di Angelica sinensis, 100 g di Paeonia lactiflora bianca, 100 g di Atractylodes macrocephala saltata in padella, 100 g di Poria cocos, 80 g di preparato Radix glycyrrhizae e 20 g di erba Menthae.
2. Usando un mulino a pietra o una macchina per spolverare, schiacciare le erbe fino a ridurle in polvere fine; Diverse erbe vengono combinate nelle proporzioni di cui sopra e polverizzate in una polvere fine per mescolarsi naturalmente. Utilizzare un setaccio per farmaci da 80 maglie con un diametro interno di 180 μm ± 7,6 μm e setacciare la polvere polverizzata. Mescolare accuratamente.
3. Prendete 100 g di zenzero, aggiungete l'acqua e fatelo bollire 2 volte per 20 minuti ogni volta. Filtrate e mettete da parte.
4. Prendi una placca medicinale, immergi una piccola scopa nell'acqua di zenzero, spennellala sulla placca, prendi la polvere di cui sopra, cospargila sull'acqua di zenzero e gira la placca in modo che tutta la polvere sia bagnata e possa essere modellata a forma di palla.
   NOTA: La formazione della placca medicinale è un passaggio essenziale durante la preparazione delle pillole MTC. La maggior parte del bambù moso verrà diviso in strisce e intrecciato in uno scheletro. La pelle di bambù, o tengpi, viene intrecciata sulla superficie e diventa arrotondata. La superficie della placca deve essere ricoperta sottilmente con olio di tung e poi spazzolata con uno strato di vernice. Questo viene essiccato per diventare a tenuta stagna. Le pillole fatte in questo modo saranno rotonde e lisce.
5. Spennellare nuovamente l'acqua di zenzero, cospargere la polvere e ruotare la placca in modo che il farmaco sia gradualmente arrotondato e ingrandito. Riporre in un luogo fresco per l'asciugatura.

13. Istituzione del modello animale

1. Dopo 7 giorni di acclimatazione, dividere casualmente i topi sperimentali in 4 gruppi, vale a dire, il gruppo di operazione fittizia (Sham, in cui è stato rimosso solo il grasso intorno alle ovaie) e tre gruppi di topi ovariectomizzati costituiti da un gruppo modello (OVX) e gruppi di somministrazione di pillole Xiaoyao a bassa e alta concentrazione.
2. Anestetizzare i topi con pentobarbital di sodio al 3% (40 mg/kg) iniettato per via intraperitoneale. Verificare che i topi entrino nello stato di anestesia osservando il rilassamento muscolare generalizzato, la respirazione profonda e lenta e il movimento rallentato. Applicare un unguento per gli occhi sugli occhi dei topi prima dell'intervento chirurgico.
3. Posizionare gli animali in posizione prona e radere la regione renale della schiena con un rasoio per animali. Eseguire la disinfezione locale con etanolo al 75%.
4. Praticare un'incisione longitudinale di circa 1 cm bilateralmente, vicino alla regione dorsale del rene, e incidere la fascia per separare i muscoli e il peritoneo.
5. Individuare la parte superiore del corno uterino e le tube di Falloppio per la legatura. Inserire una pinza nell'incisione per l'esplorazione e individuare l'ovaio, racchiuso dal tessuto adiposo in un motivo a cavolfiore rosso vivo, con le tube di Falloppio disposte a spirale sotto l'ovaio, che collegano l'ovaio al corno uterino²⁵. Rimuovere le ovaie con forbici chirurgiche e sutura.
6. Rimuovere una piccola quantità di tessuto adiposo vicino all'ovaio come controllo nel gruppo operatorio fittizio. Osserva gli animali fino a quando non riprendono conoscenza. Mettere gli animali postoperatori in gabbie separate fino al completo recupero.
7. Per prevenire l'infezione, fornire ai topi gentamicina per 3 giorni dopo l'intervento. Dopo l'operazione, garantire una dieta normale e un buon ambiente di crescita in base alle condizioni effettive dei topi. In caso di anomalie, come infezione della ferita o perdita di appetito, consultare immediatamente l'istruttore del Laboratory Animal Center.

14. Somministrazione di farmaci

NOTA: Secondo la Metodologia Sperimentale di Farmacologia²⁶, la conversione dei dosaggi umani e animali utilizzati è stata di 9 g di pillole Xiaoyao per un adulto di 70 kg, equivalente a una dose (dosaggio per una singola somministrazione).

1. Per i gruppi a basso e alto dosaggio, utilizzare rispettivamente 0,683 g/kg e 2,73 g/kg per un gruppo di 8 animali. Usa la mano sinistra per immobilizzare il mouse in modo che la bocca del topo sia in linea retta con l'esofago. Tenendo l'ago della sonda nella mano destra, inserirlo delicatamente nell'esofago lungo la parete posteriore della faringe dall'angolo della bocca del topo.
2. A questo punto, la direzione dell'ago del gavage può essere leggermente modificata per stimolare un'azione di deglutizione indotta. Iniettare il farmaco. Esegui questa operazione una volta al giorno per 12 settimane.
3. Per i gruppi operati con finta e modello, somministrare soluzione salina una volta al giorno per 12 settimane in una quantità determinata dal peso dell'animale.
4. Sopprimere i topi mediante lussazione cervicale e tagliare gli arti posteriori. Scuoiare gli arti per separare il muscolo dal femore. Trattare i femori dei topi con una soluzione decalcificante EDTA per 1 mese e sostituirli con una soluzione fresca ogni giorno.

15. Colorazione con ematossilina-eosina (HE)

1. Decerare i tessuti femorali per 8 minuti e poi immergerli in etanolo a gradiente per 3 minuti; Sciacquare con acqua corrente per 1 min.
2. Aggiungere la soluzione colorante di ematossilina goccia a goccia sulle sezioni per coprire completamente il tessuto, colorare per 5 minuti e lavare con acqua di rubinetto
3. Aggiungere la soluzione di differenziazione dell'acido cloridrico al tessuto sul vetrino, assicurandosi che copra completamente il tessuto. Fermarsi quando si osserva uno scolorimento del tessuto. Risciacquare con acqua di rubinetto.
4. Aggiungere la soluzione di colorante Eosin goccia a goccia e lasciare coprire completamente il tessuto, agendo da 30 s a 2 min. Sciacquare il colorante in eccesso con acqua corrente.
5. Eseguire la disidratazione con etanolo a gradiente con etanolo anidro al 75% per 5 minuti, seguita da etanolo anidro per 5 minuti e depistare con la soluzione decerante per 3 minuti.
6. Far cadere una quantità adeguata di gomma neutra sul vetrino in base alle dimensioni del tessuto e abbassare con cautela il vetrino, evitando bolle d'aria.

16. Micro-CT e analisi immunoistochimiche

1. Rimuovere i muscoli e i legamenti in eccesso attorno ai campioni di femore da diversi gruppi di topi e fissare i tessuti del campione in paraformaldeide al 4% per 24 ore.
2. Asciugare i tessuti ossei all'aria ed eseguire la micro-CT mediante scansione del tessuto osseo al fine di ottenere dati micro-CT tridimensionali.
3. Dai blocchi di cera di topo conservati, tagliarli in sezioni continue di 6 μm di spessore e cuocere le fette a 70 °C -72 °C per 30-60 min.
4. Decerare per 8 minuti, seguito da un trattamento con etanolo anidro al 75% per 5 minuti, etanolo anidro per 5 minuti e risciacquo PBS per 5 minuti per 3 volte.
5. Eseguire la riparazione ad alta pressione EDTA per 15 minuti, seguita dal lavaggio PBS per 5 minuti per 3x.
6. Aggiungere il 3% di perossido di idrogeno goccia a goccia nel fazzoletto, incubare a temperatura ambiente per 10 minuti e lavare con PBS per 5 minuti per 3 volte.
7. Usa una penna immunoistochimica per disegnare un cerchio. Lavare con PBS lavare per 3 minuti per 3x.
8. Colorazione dell'anticorpo primario (anticorpi anticorpi anti-ALP di coniglio (1:200), anticorpi anti-COL-1 di coniglio (1:200), anticorpi anti-IL-17 di coniglio (1:275), anti-Act1 (1:500), anticorpi anti-IL-6 di coniglio (1:500)) durante la notte, seguiti da risciacquo con tampone PBS per 5 minuti per 3x.
9. Aggiungere goccia a goccia l'anticorpo secondario [Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L; 1:2000) coniugato con HRP) e incubare a temperatura ambiente per 60 minuti. Lavare con tampone PBS per 3 minuti per 3x.
10. Incubare in DAB pronto all'uso per 3-5 minuti, quindi risciacquare con PBS.
11. Eseguire la ricolorazione con ematossilina per 3 minuti, seguita dal risciacquo PBS.
12. Utilizzare la soluzione differenziante per circa 10 s, seguita dal risciacquo PBS.
13. Aggiungere la soluzione blu di ritorno per 10 s, seguita dal risciacquo PBS.
14. Eseguire il trattamento con etanolo anidro al 75% per 5 minuti, etanolo anidro per 5 minuti e chiarificare per 3 minuti. Utilizzare resina neutra per sigillare le diapositive.

Risultati

Principi attivi e obiettivi d'azione delle pillole Xiaoyao
Effettuando una ricerca nel database TCMSP e lo screening secondo i criteri di biodisponibilità orale (OB) ≥ 30% e proprietà farmaco-simili (DL) ≥ 0,18, è stata riscontrata l'esistenza di 125 principi attivi nelle pillole Xiaoyao. Tra questi, gli ingredienti 6, 4, 9, 13, 2, 6, 83 e 2 provenivano rispettivamente da Paeonia lactiflora bianca, Atractylodes macrocephala, Menthae herba, Chaihu, Angelica sinensi...

Discussione

Secondo le statistiche, l'osteoporosi causa 1,5 milioni di fratture ogni anno negli Stati Uniti e la stragrande maggioranza di queste si verifica nelle donne in postmenopausa²⁷. Con l'aumento dell'invecchiamento della popolazione, si prevede che la maggior parte delle future fratture dell'anca nel mondo si verificherà in Asia e che entro il 2050 il numero totale di queste in tutto il mondo raggiungerà gli 8,2 milioni²⁸. Il costo della prevenzione delle fratture è quasi u...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1ml Sampler	Guangxi Beilunhe Medical Industrial Group Co.	JYQ001	For anesthesia in mice
4%polyformaldehyde	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P1110	For tissue fixation
6-0 absorbable suture (angled needle)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.	HZX-06	For postoperative suturing
Absorbent cotton ball	Winner	MIANQIU-500g	For sterilization and hemostasis
Adhesive slides	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co.	188105	For tissue sectioning
Amobarbital	Sigma Aldrich (Shanghai) Trading Co.	A-020-1ML	For anesthesia in mice
Bluing Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1866	Blue coloration of the nuclei of cells after the action of hematoxylin differentiation solution
C57BL/6 mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	(SCXK 2033-0063)	For use in animal experiments
Carbon steel surgical blades	Premier Medical Equipment Co.	SP239	For mouse surgery
CIKS/TRAF3IP2 Rabbit pAb	BIOSS ANTIBODIES	bs-6202R	Binds to Act1 in tissues
Cole's Hematoxylin Solution (For Conventional Stain)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1140	For staining paraffin sections
Collagen Type I Polyclonal antibody	proteintech	14695-1-AP	Binds to COL-1 in tissues
DAB Substrate kit,20x	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	DA1010	For tissue color development
Disposable surgical sheet 50*60CM	Nanchang Xuhui Medical Equipment Co.	SP4529777	For mouse surgery
EDTA decalcification solution (pH 7.2)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	E1171-500ml	For tissue decalcification
Enhanced Endogenous Peroxidase Bloching Buffer	Beyotime Biotechnology	P0100B	Sequestration of tissue or cellular endogenous peroxidases
Environmentally friendly dewaxing clear liquid	Servicebio	G1128-1L	For dewaxing paraffin sections
Ethyl Alcohol	CHRON CHEMICALS	64-17-5 (CAS)	For dehydration of paraffin sections
General Purpose Antibody Diluent	Epizyme Biotech	PS119L	For antibody dilution
Hematoxylin Differentiation Solution	Servicebio	G1039-500ML	For differentiation after hematoxylin staining and removal of excessively bound and non-specifically adsorbed dye from tissues
Hematoxylin Eosin (HE) Staining Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1120-3*100ml	For tissue staining
High quality stainless steel surgical knife handle	Premier Medical Equipment Co.	SP0088	For mouse surgery
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	proteintech	SA00001-2	Binds to primary antibody and amplifies signal
IL-17A Polyclonal antibody	proteintech	13082-1-AP	Binds to IL-17 in tissues
IL-6 Polyclonal antibody	proteintech	21865-1-AP	Binds to IL-6 in tissues
Immunohistochemistry pen	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.	ZLI-9305 (YA0310)	For drawing circles in immunohistochemistry
Medical surgical suture Non-absorbent (ball) 5-0 3.5m	Yangzhou Yuanlikang Medical Equipment Co.	FHX-5-2	For postoperative suturing
Medical Suture Needles Angle Needles 4*10 3/8	Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.	FHZ612-4	For postoperative suturing
Neutral Balsam	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G8590	As a slice sealer
PBS(1X)	Shenzhen Mohong Technology Co.,Ltd	B0015	Buffer for slide washing and partial solution dilution
Protein Free Rapid Blocking Buffer (1X)	Epizyme Biotech	PS108P	Avoiding non-specific binding of proteins
Rabbit Anti-Bone Alkaline Phosphatase antibody	BIOSS ANTIBODIES	bs-6292R	Binds to alkaline phosphatase in tissues
Saline	Affiliated Hospital Youjiang Medical University For Nationalities	LHN500	For animals by gavage
Shaving/Electric clippers	HANGZHOU HUAYUAN PET PRODUCTS CO., LTD.	DTJ-002	For shaving mice
Stainless Steel Medical Needle Holder 14cm Coarse Needle	Premier Medical Equipment Co.	SP784	For mouse surgery
Stainless Steel Ophthalmic Forceps 10.5cm Curved (No Hook)	Zhuoyouyue	YKNWW-10.5	For mouse surgery
Stainless Steel Ophthalmic Scissors/Surgical Scissors 10CM Straight Tip	Premier Medical Equipment Co.	ZYJD-10-ZJ	For mouse surgery
Stainless Steel Tip Gastric Needle 12 Gauge 55mm Elbow		GWJ-12-55W	For use in mice by gavage
Tris-EDTA Antigen Repair Fluid (50x)	proteintech	PR30002	For antigen repair of paraffin sections
Wooden dissecting board 25*16cm		JP16*24	For mouse surgery
Xiaoyao pills	Jiuzhitang Co.,Ltd.	YPG-041	For animal drug delivery
Others
R 4.3.1			Data processing
Cytoscape3.9.1	National Resource for Network Biology		Building a regulatory network for traditional Chinese medicine
ImageJ 1.54f	National Institutes of Health		Image processing for immunohistochemistry results
Adobe Photoshop 24.0.0	Adobe		For image combination
GraphpadPrism 9.5	GraphPad Software		Statistical analysis of data
cellsens Dimension	OLYMPUS		For slicing and photographing
OLYMPUS BX53	OLYMPUS		For HE staining and immunohistochemical section photography