Questo progetto è stato condotto con il finanziamento del chimico, biologico, radiologico e nucleare (CBRN) Iniziativa Ricerca e Tecnologia (CRTI) della Canadian Food Inspection Agency, e il prione Alberta Research Institute. La Fondazione Nazionale di Scienze Naturali di Cina ha fornito una borsa di studio (n. 30620120430) a W. Xu. Gli autori ringraziano Brant Baker e Fred Van Herk, così come Ruth Barbieri, Lisa Kalischuk-Tymensen, Andrew Olson, Lorna Selinger, Geoff Wallins e Homayoun Zahiroddini per la loro assistenza tecnica.

Duplicare strutture compost sono stati costruiti presso il Centro di Ricerca Lethbridge (LRC) a Lethbridge, Alberta, Canada (Fig. 1). Rettangolare balle di paglia d&#39;orzo (260 x 120 x 80 cm L x P x A) sono stati utilizzati per le pareti, e balle di piccole dimensioni (100 x 40 x 45 cm) per il pavimento. Balle grandi erano orientati in modo pareti erano 120 cm di spessore, che la stabilità della parete massimizzata e ritenzione di calore. Le piccole balle che formano il pavimento erano orientati con spago che corre orizzontalmente per massimizzare assorbimento in caso di una perdita, ottenendo un pavimento 45 centimetri di spessore. Ingombri delle strutture erano 25 mx 5 mx 2,4 m; L x W x H). Il cantiere aveva una pendenza di circa 1, e le strutture sono state orientate a favorire il flusso del percolato verso il porto di campionamento che abbiamo inserito per la valutazione sperimentale. Feedlot letame umido è stato mixato e le acque da lavorazione attraverso un diffusore di concime e accumulando per 24 ore prima della costruzione delle strutture di contenimento. Il bunker compost sono stati rivestiti con pesanti teli di plastica nero / bianco comunemente utilizzati per coprire cumuli dell&#39;insilato. Avanzo sufficiente era rimasto sopra le righe in ogni direzione per permettere eventuali piegare verso il basso e la sigillatura del letto compost all&#39;interno del bunker. Per combattere una brezza ambiente, i pneumatici sono stati utilizzati per il peso della plastica nel bunker fino a quando la paglia è stato caricato, ma questi sono stati rimossi prima che le carcasse di essere immessi. Una volta che la porta di campionamento del percolato (necessario per il campionamento solo sperimentale) è stato installato, paglia d&#39;orzo sciolto è stato aggiunto nel bio-contenimento struttura per formare uno strato di base di circa 40 cm di spessore. Ciò è stato realizzato, fornendo una balla sola rotonda con un caricatore frontale, e distribuire manualmente la paglia per tutta la lunghezza del bunker. Sedici bestiame feedlot mortalità sono stati collocati sul letto di paglia. Erano bestiame che erano morti nei precedenti 48 ore al vicino allevamenti commerciali, la maggior parte aver ceduto alla malattia respiratoria del bovino. Le carcasse sono state allineate trasversalmente all&#39;interno del bunker di compostaggio (Fig. 1), con uno spazio di circa 0,5 m tra le carcasse. Per fornire aerazione passiva, le lunghezze dei tubi flessibili perforata di drenaggio in plastica (15 cm di diametro) sono state stabilite tra le carcasse adiacenti, incorporato all&#39;interno della base di paglia sciolto. Le estremità del tubo sono stati diretti in verticale lungo le pareti laterali si estende oltre la parte superiore del bunker, e tenuto in posizione temporaneamente utilizzando pneumatici si estende oltre la superficie superiore delle pareti. Pre-condizione letame feedlot è stato caricato nel bunker per coprire le carcasse ad una profondità finale di 1,6 m. Il letame è stato caricato sulla parete laterale del bunker, spostandosi da un capo all&#39;altro della struttura verso l&#39;altro. Le piramidi campione recupero descritti di seguito sono stati posizionati al loro profondità prescritto all&#39;interno dello strato di letame durante questa fase. Una volta che il bunker è stato riempito, il teli di plastica era ripiegato sopra la parte superiore del letame accatastato e le estremità del tubo forato erano passati attraverso di esso in modo che essi si trovavano all&#39;esterno del capo. La plastica è stata sigillata con nastro adesivo per creare una barriera di contenimento attorno al, carcasse di paglia e letame. Otto bocchette di aerazione (50 x 50 x 15 cm) sono stati collocati in cima ad ogni struttura per promuovere aerazione passiva, a forma di T connettori sono state allegate a ciascuna estremità delle lunghezze dei tubi forati per promuovere il flusso d&#39;aria verso il basso nei tubi. In questo studio pilota, sperimentali modifiche alle strutture compost sono stati incorporati che consentano loro di inattivazione dei patogeni e di degrado del tessuto durante il processo di compostaggio statico. Campioni di tessuto e microbiche pre-quantificato in peso dei tessuti o di enumerazione microbica sono termosaldate in sacchetti di nylon del campione (5 x 9 cm; 50-micron dimensione dei pori), e confezionato in speciali gabbie d&#39;acciaio piramidale, designato come Baker Piramidi Retrieval (BRP) 1. Queste piramidi sono stati progettati per permettere il loro recupero dalla matrice compost ad intervalli durante il processo di compostaggio, senza compromettere seriamente il contenimento o alterare le dinamiche del processo di compostaggio All&#39;interno di un BRP, otto cuscini (uno ciascuno degli otto tipi di campioni) sono stati incorporati nel letame stesso che è stato utilizzato per riempire il bunker, disposte in modo che ogni sacco era circondato da sacchi di letame e non erano in contatto diretto con un altro. BRPs letame e sacchetto pieno erano attaccati alla lunghezza della catena di registrazione e sospeso ad una profondità di 80 cm e 160 cm all&#39;interno della matrice compost. Le catene sono state ancorate a pali di legno che attraversa il bunker a intervalli di 1,5 m (Fig. 1). T-tipo termocoppie poste in ogni BRP sono stati corrono lungo le catene ad un data logger posizionato esternamente alla struttura compost. A intervalli specifici, BRPs sono stati ritirati in verticale dal terriccio con un libero sfogo come-lungo cavo estrattore, e l&#39;involucro di plastica è stato nuovamente sigillato. Nel clima naturalmente arido del sud Alberta, poca pioggia è stato ricevuto durante til suo periodo, ma l&#39;involucro di plastica e la forma a cupola del materiale di compostaggio sono stati efficaci per promuovere il deflusso laterale per essere assorbiti dalle pareti del bunker paglia.

<ol>
	<li>Reuter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+temporal+collection+of+tissue+and+microbial+samples+from+static+composting+systems.">A simple method for temporal collection of tissue and microbial samples from static composting systems.</a> Canadian Biosystems Engineering. 50, 6.17-6.20 (2008).</li><li>Xu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biosecure+composting+system+for+disposal+of+cattle+carcasses+and+manure+following+infectious+disease+outbreak.">A biosecure composting system for disposal of cattle carcasses and manure following infectious disease outbreak.</a> J. Environ. Qual. 38, 437-450 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Dopo 147 giorni di compostaggio statico, perdite di massa totale, sostanza secca (SS), materia organica, carbonio totale, azoto totale era pari al 23,7, 35,6, 52,9, 49,6 e 41,4%, rispettivamente 2. All&#39;interno di ogni struttura, il volume di materiale compostato diminuito 118-71 m 3. Decomposizione dei tessuti bovini monitorato classificato come cervello&gt; zoccolo osso&gt;. Dopo soli 7 giorni di compostaggio,&gt; 90% del tessuto cerebrale DM era decomposto, e l&#39;80% dello zoccolo DM era decomposto in 56 d di compostaggio. Completa perdita di vitalità di Escherichia coli O157: H7 e malattia di Newcastle è stata raggiunta entro 14 giorni. Intensivi sistemi di produzione animale sono particolarmente vulnerabili al naturale o intenzionale epidemie di malattie infettive. Ospita un gran numero di animali all&#39;interno di un&#39;area confinata dà luogo ad agenti infettivi più diffondendo rapidamente in tutta la popolazione. Il contenimento è la chiave per controllare eventuali focolai di malattie infettive, in tal modo lo spopolamento è usato frequentemente come un mezzo per prevenire la diffusione dell&#39;agente infettivo per la popolazione di bestiame più grande. Lo spopolamento risultati scenario in un gran numero di carcasse di animali e letame contaminato da smaltire rapidamente. Il compostaggio si presta come una risposta rapida metodo di smaltimento per le carcasse infette e letame e il terreno che possono ospitare agenti infettivi. Noi descrivere una procedura di compostaggio che possono essere condotti presso il sito del focolaio della malattia, utilizzando materiali facilmente disponibili in azienda o da locale azienda di alimentazione negozi. Nel nostro studio, agenti infettivi associati a carcasse di bovini da carne e letame sono stati inattivati ​​entro 14 giorni di compostaggio, una temperatura compost superato i 55 ° C per più di un mese. La produzione di percolato è stata estremamente bassa, probabilmente a causa della natura assorbente dello strato sciolto di base di paglia e la nostra avendo ottimizzato il contenuto DM all&#39;inizio della compostaggio. Resa totale di percolato sono stati meno di 3 ppm della massa iniziale compost (cioè &lt;300 g per struttura). Coliformi sono stati rilevati nel percolato fino a 5,8 log10 CFU / ml a 14 giorni, ma non erano rilevabili dopo 101 giorni di compostaggio. Dopo 147 giorni, le carcasse dei bovini sono stati quasi completamente degradato con solo qualche osso lungo, di riconoscibile. Ossa erano degradati ulteriormente durante il supplementare aperto andana ciclo di compostaggio, dopo le strutture biocontained sono stati aperti, ottenendo finale compost maturo adatto per applicazione al terreno. In conclusione, il compostaggio crea le condizioni che presentano notevoli sfide per la sopravvivenza della maggior parte dei microrganismi patogeni. Batteri liberi, protozoi e virus sono rapidamente inattivato dalle alte temperature, elevata alcalinità e proteasi e nucleasi attività all&#39;interno di compost. Questa decomposizione delle carcasse di successo maturo bestiame feedlot indica che questa procedura di smaltimento statici di compostaggio sarebbe adatto per tutti gli animali comuni. Bisogna fare attenzione, tuttavia, per garantire che ottimale di carbonio: i rapporti di azoto e livelli di umidità sono presenti in ordine di uccidere microbica condizioni da raggiungere. Patogeni intrinsecamente più resistenti al calore, come i batteri che le spore forma (ad esempio, l&#39;antrace), o quelli che sono insolitamente recalcitranti, come i prioni, può ancora restare infettive dopo compostaggio. Studi per chiarire il destino di questi tipi di microrganismi durante il processo di compostaggio sono attualmente in corso nel nostro laboratorio. <img src="/files/ftp_upload/1946/1946fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Rappresentazione schematica del sistema di compost biosicurezza che comprende pareti balle di paglia e terra, recinto teli di plastica, paglia di base sciolto, carcasse di animali, il letame, perforato tubi di ventilazione in plastica, e prese d&#39;aria, nonché gli emendamenti sperimentale (percolato porta, il recupero del campione piramidi e sensori di temperatura. (A) vista trasversale (sezione trasversale). (B) Vista longitudinale (parete laterale rimosso). Tutte le misure sono in cm. Da Xu et al. (2009) 2

biocontained carcass composting for control of infectious disease outbreak in livestock

Intensivi sistemi di produzione animale sono particolarmente vulnerabili al naturale o intenzionali (bioterrorismo) epidemie di malattie infettive. Un gran numero di animali alloggiati all&#39;interno di una zona limitata permette la rapida diffusione di agenti infettivi più tutta una mandria. Rapido contenimento è la chiave per controllare eventuali focolai di malattie infettive, in tal modo lo spopolamento è spesso impegnata a prevenire la diffusione di un agente patogeno per la popolazione di bestiame più grande. In quella circostanza, un gran numero di carcasse di animali e letame contaminato sono generati che richiedono un rapido smaltimento. Il compostaggio si presta come una risposta rapida metodo di smaltimento per le carcasse infette e letame e il terreno che possono ospitare agenti infettivi. Abbiamo progettato un bio-contained procedura di compostaggio di mortalità e testato la sua efficacia per la degradazione dei tessuti bovini e disattivazione microbica. Abbiamo utilizzato materiali disponibili in azienda o acquistabile nei negozi di forniture per azienda in modo che il sistema può essere implementato nel sito di insorgenza della malattia. In questo studio, le temperature superato i 55 ° C per più di un mese e agenti infettivi impiantati nelle carcasse di bovini da carne e letame sono stati inattivati ​​entro 14 giorni di compostaggio. Dopo 147 giorni, le carcasse sono state quasi completamente degradata. Le ossa lunghe pochi rimasti sono stati ulteriormente degradata con un ciclo di compostaggio in cumuli supplementare aperto e il compost maturo finale era adatto per applicazioni terrestri. Duplicare strutture compost (dimensioni finale 25 mx 5 mx 2,4 m; L x P x A) sono stati costruiti utilizzando balle di paglia d&#39;orzo e fiancheggiata da pesanti teli di plastica nera insilati. Ogni stato caricato con paglia sciolti, carcasse e concimi per un totale di ~ 95.000 kg. A 40 cm di strato di base di paglia d&#39;orzo sciolto è stato posto in ogni bunker, su cui sono stati collocati 16 bestiame feedlot mortalità (peso medio 343 kg) allineate trasversalmente ad una distanza di circa 0,5 m. Per l&#39;aerazione passiva, lunghezze di flessibili, tubi di drenaggio in plastica forata (15 cm di diametro) sono stati collocati tra le carcasse adiacenti, che si estende verticalmente lungo entrambe le pareti interne, e con le estremità passato anche se la plastica verso l&#39;esterno. Le carcasse sono stati sovrapposti con letame umido feedlot gassose (~ 1,6 m di profondità) alla cima del bunker. Plastica era ripiegato sopra la parte superiore e sigillato con nastro adesivo per creare una barriera di contenimento e otto bocchette di aerazione (50 x 50 x 15 cm) sono stati collocati in cima ad ogni struttura per promuovere aerazione passiva. Dopo 147 giorni, la perdita di volume e la massa di materiale compostato media del 39,8% e 23,7%, rispettivamente, in ogni struttura.

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Biocontained Carcass Composting for Control of Infectious Disease Outbreak in Livestock

Utilizzando materiali facilmente reperibili, questo sistema consente di compostaggio biocontained efficace sul sito di smaltimento delle carcasse di animali di grandi dimensioni che sorgono nel caso di insorgenza di malattie infettive. Questa procedura uccide maggior parte degli agenti infettivi nelle carcasse e letame contaminato. Una volta che l&#39;agente infettivo è confermata non vitale, compost maturo può essere diffuso come fertilizzante.

Carcassa di compostaggio Biocontained per il controllo di focolai di malattie infettive del bestiame

Intensive livestock production systems are particularly vulnerable to natural or intentional (bioterrorist) infectious disease outbreaks. Large numbers of ...

biocontained-carcass-composting-for-control-infectious-disease

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.8K Views.  Lethbridge Research Centre. Utilizzando materiali facilmente reperibili, questo sistema consente di compostaggio biocontained efficace sul sito di smaltimento delle carcasse di animali di grandi dimensioni che sorgono nel caso di insorgenza di malattie infettive. Questa procedura uccide maggior parte degli agenti infettivi nelle carcasse e letame contaminato. Una volta che l'agente infettivo è confermata non vitale, compost maturo può essere diffuso come fertilizzante.

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Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

Saliva, le ghiandole salivari, e Collection emolinfa dalle zecche Ixodes scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Creazione di un liquido coperto Cultura polarizzata Airway epiteliali umane Calu-3 celle per studio cellulare risposta dell&#39;ospite agli agenti patogeni delle vie respiratorie<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Tampone Metodo di campionamento per la rilevazione di Norovirus umana sulle superfici

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Salvataggio e caratterizzazione del virus ricombinante da un nuovo mondo Clone infettivo del virus Zika

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Neutralizzando le risposte dell'anticorpo al virus A(H3N2) in sieri umani di Microneutralization l'Influenza di misurazione analisi utilizzando cellule MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Valutazione delle risposte a cellula T Zika Virus-specifici in organi di nuova di Ifnar1 infetti- / - Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

Identificazione dei Mouse e dei repertori di anticorpo umano mediante sequenziamento di nuova generazione

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. While the direct fluorescent antibody (DFA) test or the direct rapid immunohistochemical test (DRIT) are most commonly utilized for the antigen detection, both tests require fresh and/or frozen tissues for impressions on slides prior to the antigen detection using antibodies. If samples are collected and fixed in formalin, neither test is optimal for the antigen detection, however, testing can be performed by conventional immunohistochemistry (IHC) after embedding in paraffin blocks and sectioning. With this IHC method, tissues are stained with anti-rabies antibodies, sections are deparaffinized, antigen retrieved by partial proteolysis or other methods, and incubated with primary and secondary antibodies. Antigens are stained using horseradish peroxidase / amino ethyl carbazole and counterstained with hematoxylin for the visualization using a light microscope. In addition to the specific antigen detection, formalin fixation offers other advantages like the determination of histological changes, relaxed conditions for specimen storage and transport (under ambient temperatures), ability to test retrospective cases and improved biological safety through the inactivation of infectious agents.

Here, we present an immunohistochemistry test protocol for the detection of rabies virus antigen as an alternative diagnostic test for formalin-fixed tissues.

Test immunoistochimico per il rilevamento dell'antigene del lyssavirus da tessuti fissati con formalina

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Quantificazione degli anticorpi neutralizzanti indotti dal vaccino nelle varianti di SARS-CoV-2

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 variants and the effectiveness of vaccine-induced neutralizing antibodies against viral variants. These assays are essential for pandemic surveillance and validating vaccines and variant-specific boosters. This manuscript demonstrates the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) for quick quantification of SARS-CoV-2 variant infectivity and vaccine-induced neutralizing antibodies to viral variants. Ha-CoV-2 is a SARS-CoV-2 virus-like particle consisting of viral structural proteins (S, M, N, and E) and a fast-expressing RNA genome derived from an alphavirus, Semliki Forest Virus (SFV). Ha-CoV-2 also contains both green fluorescent protein (GFP) and luciferase reporter genes that allow for quick quantification of viral infectivity. As an example, the infectivity of the SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) and the Omicron (B.1.1.529) variants are quantified, and their sensitivities to a neutralizing antibody (27VB) are also measured. These examples demonstrate the great potential of Ha-CoV-2 as a robust platform for rapid quantification of SARS-CoV-2 variants and their susceptibility to neutralizing antibodies.

Autore in primo piano: Un sistema di virus pseudotipo per la valutazione delle sottovarianti di Omicron e degli anticorpi neutralizzanti nella ricerca su SARS-CoV-2

This protocol describes the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) as a platform for rapid quantification of infectivity of SARS-CoV-2 variants and their sensitivity to neutralizing antibodies.

Applicazione dello pseudovirus Ha-CoV-2 per la quantificazione rapida delle varianti di SARS-CoV-2 e degli anticorpi neutralizzanti

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...