Per iniziare, seminare le cellule di osteosarcoma umano 143B in una piastra a sei pozzetti. Una volta che le cellule diventano confluenti al 75%, sostituire il mezzo in ciascun pozzetto con il mezzo contenente 10 millimolari di aspartato 13C4 e incubare per otto ore per ottenere uno stato stazionario per l'etichettatura delle cellule. Per isolare i metaboliti, raffreddare il tampone preparato durante la notte a meno 80 gradi Celsius o posizionarlo su ghiaccio secco.
Nel frattempo, prendere una piastra dall'incubatore e aspirare il mezzo da ciascun pozzetto usando una pipetta. Lavarlo con PBS due volte, quindi rimuovere il PBS residuo prima di procedere ulteriormente. Ora posiziona la piastra su ghiaccio secco e aggiungi 800 microlitri di tampone preparato a ciascun pozzetto.
Per facilitare la lisi cellulare, incubare la piastra per 15 minuti a meno 80 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, raschiare ogni pozzetto sul ghiaccio secco utilizzando un sollevatore di cellule e trasferire il lisato in un tubo di microcentrifuga da 15 millilitri posto su ghiaccio secco. Vortice il lisato per 10 minuti a quattro gradi Celsius e centrifugarlo a quattro gradi Celsius e 17.000 g per 10 minuti.
Quindi trasferire il surnatante in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri e asciugarlo in un concentratore di vuoto a quattro gradi Celsius con una trappola fredda sotto un alto vuoto per circa sei ore. Conservare il pellet di metabolita essiccato a meno 80 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Per analizzare il campione utilizzando la spettrometria di massa per cromatografia liquida o LCMS, aggiungere 100 microlitri di acqua di grado HPLC al pellet essiccato e al vortice come dimostrato.
Centrifugare i campioni a quattro gradi Celsius per 10 minuti alla massima velocità. Quindi trasferire 25 microlitri di surnatante nel flaconcino LCMS e iniettare due microlitri nel sistema LCMS. Per eseguire la cromatografia liquida, utilizzare una portata costante di 0,15 millilitri al minuto, in modalità gradiente di una fase mobile B dall'80 al 20% per 20 minuti, dal 20 all'80% per 0,5 minuti e mantenere l'80% per 7,5 minuti rispetto alla fase mobile A.Quindi, eseguire la spettroscopia di massa scegliendo una scansione completa tra mz 70 a 1, 000 Dalton.
E risoluzione a 70.000. Impostare l'obiettivo AGC di una volta 10 alla sesta e un tempo massimo di iniezione di 20 millisecondi. Quindi, impostare il runtime su 16,5 minuti.
Polarità impostata su positiva. Obiettivo AGC fissato a uno alla potenza di cinque. IT massimo impostato su 20 millisecondi.
E intervallo di scansione impostato su 70 a 1.000 rapporto massa-carica. Quindi impostare la tensione di spruzzatura a 3,0 kilovolt. E il capillare riscaldato a 275 gradi Celsius.
Selezionare il flusso di gas della guaina a 40 unità, il flusso di gas ausiliario a 15 unità e il flusso di gas spazzato a un'unità. Per il tracciamento degli isotopi della glutammina 13C5, una volta che le cellule raggiungono il 75% di confluenza, cambiare il mezzo in due millimolari contenenti glutammina 13C5 e incubare per ottenere uno stato costante di etichettatura delle cellule di interesse. Isolare e analizzare i metaboliti come precedentemente dimostrato.
Dopo aver isolato e analizzato i metaboliti, analizzare l'attività della succinato deidrogenasi o SDH calcolando l'etichettatura percentuale di 13C3 fumarato, 13C4 fumarato, 13C3 succinato e 13C4 succinato. Quindi valutare l'ossidazione del succinato e la riduzione del fumarato utilizzando la formula. In condizioni di veicolo, il complesso SDH ha favorito l'attività in avanti e l'incorporazione di 13C4 succinato in 13C4 fumarato era superiore a 13C3 fumarato in 13C3 succinato.
Nelle cellule di osteosarcoma trattate con antimicina, il complesso SDH ha favorito l'attività inversa e l'incorporazione del fumarato di 13C3 nel succinato 13C3 è stata più significativa del succinato di 13C4 nel fumarato 13C4.
