Il primo giorno dopo la reticolazione della cromatina e la raccolta dei nuclei da 5.000 giovani vermi adulti Caenorhabditis Elegans, trasferire il pellet di nuclei risospeso in 450 microlitri di acqua pulita in un tubo di microcentrifuga pulito da 1,5 millilitri. Quindi aggiungere 60 microlitri di tampone enzimatico di restrizione DPN2 10X e mescolare bene. Incubare i campioni con 15 microlitri di sodio dodecilsolfato al 10% a 37 gradi Celsius per un'ora agitando.
Estinguere la reazione aggiungendo 75 microlitri di tritone X 100 al 20% e incubando come dimostrato in precedenza. Aliquot 10 microlitri dal campione, come controllo non digerito, e conservarlo a quattro gradi Celsius. Dopo aver aggiunto 400 unità di DPN 2 al resto del campione, incubarlo durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione per la digestione della cromatina.
Il secondo giorno, aggiungere altre 200 unità di DPN 2 al campione. Per completare la digestione del campione reticolato, incubarlo a 37 gradi Celsius agitando per quattro ore. Il calore inattiva l'enzima di restrizione incubando il campione per 20 minuti a 65 gradi Celsius.
Se l'enzima non può essere inattivato dal calore, aggiungere 80 microlitri di sodio dodecilsolfato al 10% e incubare. Quindi, aggiungere 375 microlitri di Triton X 100 al 20% al campione e mescolare ruotando. Tenere da parte un'aliquota da 10 microlitri dal campione come controllo della digestione.
Per la legatura della cromatina, trasferire il campione in un tubo conico pulito da 50 millilitri. Regolare il volume del campione a 5,7 millilitri con acqua di grado molecolare e mescolare ruotando. Quindi, aggiungere 700 microlitri di tampone 10 X T4 ligasi, seguito da 60 unità di T4 DNA ligasi e incubare il campione durante la notte a 16 gradi Celsius.
Il terzo giorno, procedere con la digestione delle proteine e la reticolazione inversa. Aggiungere 30 microlitri di 10 milligrammi per millilitro di proteinasi K al campione 3C e incubare a 65 gradi Celsius durante la notte agitando. Per iniziare la purificazione della libreria 3C il quarto giorno, aggiungere 30 microlitri di 10 milligrammi per millilitro di RNasi A al campione e mescolare ruotando.
Dopo l'incubazione, aggiungere sette millilitri di fenil cloroformio ai campioni e mescolare agitando. Centrifugare il campione per 15 minuti a 3, 270 G e temperatura ambiente. Raccogliere e trasferire la fase acquosa in un tubo conico pulito da 50 millilitri.
Aggiungere volumi uguali di cloroformio e mescolare il campione agitando. Dopo aver centrifugato nuovamente il campione come dimostrato, trasferire la fase acquosa in un altro tubo conico pulito da 50 millilitri. Aggiungere 7,5 millilitri di acqua di grado molecolare, 35 millilitri di etanolo al 100% e sette microlitri di un milligrammo per millilitro di glicogeno.
Congelare il campione correttamente miscelato a meno 80 gradi Celsius. Mentre il campione si congela, iniziare a purificare i campioni di controllo regolando il volume dei controlli a 500 microlitri utilizzando acqua di grado molecolare. Aggiungere due microlitri di 10 milligrammi per millilitro di RNasi A e mescolare facendo scorrere il tubo.
Quindi, aggiungere un millilitro di fenil cloroformio ai tubi contenenti i controlli e mescolare agitando. Centrifugare i tubi. Dopo aver trasferito la fase acquosa in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri, aggiungere volumi uguali di cloroformio.
Centrifugare come precedentemente dimostrato prima di raccogliere la fase acquosa. Alla fase acquosa raccolta, aggiungere un millilitro di etanolo e due microlitri di un milligrammo per millilitro di glicogeno. Dopo aver mescolato il campione agitando, incubarlo a meno 80 gradi Celsius per 30 minuti.
Quindi, centrifugare il campione per 15 minuti a 3.270 G a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il surnatante, aggiungere 750 microlitri di etanolo refrigerato al 70% e centrifugare. Risospendere il pellet essiccato all'aria in 50 microlitri di acqua di grado molecolare.
La sospensione può essere congelata qui se non si procede ulteriormente immediatamente. Per continuare con la purificazione del campione 3C, rimuovere il campione dal congelatore e centrifugare a 3.270 G per 30 minuti. Aggiungere 10 millilitri di etanolo refrigerato al 70% e rompere il pellet di DNA.
Dopo aver centrifugato e rimosso il surnatante, asciugare parzialmente all'aria il campione a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in 150 microlitri di 10 millimolari tris HCL a pH 7,5 mediante pipettaggio su e giù per ottenere la libreria 3C purificata. La QPCR eseguita su un campione sperimentale e due campioni di controllo 3C ha contribuito a generare i dati sull'efficienza della digestione.
Il campione 3C ha avuto un'efficienza di digestione di circa l'88% nei sette loci genomici testati.
