Per iniziare, prelevare il campione di tessuto clinico archiviato o fresco digerito ed espanso e procedere con la colorazione degli anticorpi posizionandolo in un singolo pozzetto di una piastra di coltura cellulare a sei pozzetti. Lavare il campione tre volte con PBS per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente. A seconda della dimensione del campione, aggiungere da 0,5 a 2 millilitri di anticorpi primari nel tampone colorante per coprire adeguatamente il gel.
Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Quindi, lavare il campione tre volte con PBS per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente. Aggiungere gli anticorpi secondari corrispondenti e incubare per tre ore a 37 gradi Celsius nel tampone colorante scelto.
Rilavare il campione come dimostrato in precedenza e aggiungere da 1 a 2 millilitri di glicole polietilenico sul campione in una piastra a sei pozzetti. Colorare il campione con estere NHS coniugato Fluor 4 per tre ore a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, lavare il campione tre volte con PBS.
Successivamente, per eseguire la colorazione dei lipidi, prelevare il campione di tessuto espanso lavato tre volte in PBS, applicare un colorante lipofilo convenzionale diluito 200 volte in 2 millilitri di Triton X-100 o PBS allo 0,1% per 72-96 ore a temperatura ambiente e lavare almeno tre volte con PBS. Per eseguire la FISH, preparare il tampone di ibridazione combinando 2 x SSC, 10% di destrano solfato, 20% di carbonato di etilene e 0,1% di interpolazione 20. Posizionare i campioni di gel omogeneizzati in un tampone di ibridazione preriscaldato a 60 gradi Celsius per 30 minuti.
Quindi, incubare i campioni di gel con un tampone di ibridazione contenente 10 sonde FISH picomolar contro il gene bersaglio durante la notte a 45 gradi Celsius. Lavare i campioni con tampone di lavaggio rigoroso due volte per 15 minuti ciascuno a 45 gradi Celsius e due volte per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Lavare il campione tre volte con PBS per 10 minuti e procedere con l'imaging o conservare il campione in PBS più 0,02% di azoturo di sodio a 4 gradi Celsius.
Per espandere completamente e visualizzare il tessuto, spostare i campioni espansi di quattro volte in PBS su una piastra di imaging a sei pozzetti con fondo di vetro. Se il campione è stato ulteriormente ampliato, tagliarlo in pezzi più piccoli. Applicare 0,1% polilisina sulla superficie del vetro.
Posizionare il campione sul vetrino e rimuovere il liquido in eccesso intorno al gel con un panno da laboratorio di carta per impedire il movimento del gel durante l'imaging. Successivamente, eseguire l'imaging a fluorescenza utilizzando un microscopio convenzionale a campo largo, un microscopio confocale o un altro sistema di imaging preferito. Dopo l'imaging, ridurre i campioni in PBS con almeno tre lavaggi di 10 minuti, poiché la conservazione a lungo termine in acqua deionizzata porta alla degradazione del segnale fluorescente.
Infine, conservare i campioni in PBS con 0,02% di azoturo di sodio a 4 gradi Celsius. Le immagini confocali del tessuto cerebrale di topo completamente espanso hanno permesso la visualizzazione delle proteine e delle strutture cellulari e della membrana mitocondriale. Sono stati identificati anche gli acidi nucleici del tessuto linfonodale umano formale e fisso incorporato nella paraffina.
Dopo un'espansione di 3,5 volte della sezione renale, è stato visto il glomerulo espanso privo di crepe. Tuttavia, l'ancoraggio o l'omogeneizzazione inadeguati hanno provocato crepe, distorsioni e la perdita di bersagli etichettati in un'altra sezione renale.
