Inizia preparando tutti i reagenti prima dell'esperimento e scongela la matrice della membrana basale sul ghiaccio. Quindi preparare il mezzo monostrato murino. Diluire la membrana basale scongelata da uno a 20 con il mezzo monostrato murino freddo e tenerlo sul ghiaccio.
Posizionare un inserto di coltura cellulare trasparente da 0,4 micrometri, utilizzando una pinza sterile, in un singolo pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Prendi una punta angolare dell'inserto e trasferiscila nel pozzo. Ripetere l'operazione fino a quando non è disponibile il numero appropriato di inserti di coltura cellulare per la coltura.
Per coprire la superficie apicale di ciascun inserto di coltura cellulare con matrice di membrana basale diluita, posizionare la punta della pipetta P 200 al centro dell'inserto ed espellere la matrice da 150 microlitri. Quindi, trasferire la piastra in un'incubatrice sterile a 37 gradi con anidride carbonica al 5%, per almeno un'ora. Alla fine dell'incubazione, ruotare la piastra a 24 pozzetti con un angolo di 45 gradi.
Posizionare un solo dito sull'angolo della punta per stabilizzare l'inserto. Posizionare delicatamente la punta della pipetta P 200 lungo il lato inferiore dell'inserto e rimuovere la matrice del basamento. Rimuovere eventuali residui in eccesso lavando ogni inserto di coltura cellulare con 150 microlitri di DPBS sterile senza ioni calcio o magnesio e lasciarli asciugare in una camera di sicurezza biologica per un minimo di 10 minuti.
Una volta asciugati gli inserti, aggiungere 400 microlitri di mezzo monostrato murino sul fondo e 75 microlitri sopra l'inserto di coltura cellulare. Ripetere l'operazione fino a quando tutti gli inserti di coltura cellulare sono immersi. Lasciare la piastra nell'armadio di sicurezza biologica o nell'incubatore fino al momento del bisogno.
Quindi rimuovere la piastra a 24 pozzetti di colonoidi intestinali maturi dall'incubatore e posizionarla sotto l'armadio di sicurezza biologica. Aspirare il mezzo utilizzando punte sterili e lavare ogni pozzetto con un millilitro di DPBS sterile a temperatura ambiente. Utilizzando punte sterili, rimuovere il DPBS senza ioni di calcio o magnesio.
Digerire ogni tappo della matrice della membrana basale aggiungendo 500 microlitri di reagente di dissociazione enzimatica in ciascun pozzetto da far passare. Per rompere la spina, ruotare la piastra a 24 pozzetti con un angolo di 45 gradi. Posizionare la punta della pipetta sul bordo della spina e spostarla delicatamente mediante pipettaggio di ciascuna spina da sei a 10 volte.
Riporre la piastra a 24 pozzetti in un'incubatrice sterile a 37 gradi con il 5% di anidride carbonica, per tre o quattro minuti. Dopo l'incubazione, pipettare la tripsina su e giù da cinque a sette volte per ciascun pozzetto sotto un armadio di sicurezza biologica. Trasferire i colonoidi dissociati da ciascun pozzetto in un tubo conico sterile da 15 millilitri e portare fino a un volume di 10 millilitri con un mezzo di lavaggio del topo ghiacciato.
Quindi, centrifugare i colonoidi parzialmente digeriti a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius in una centrifuga a secchio oscillante. Sotto l'armadio di sicurezza biologica, rimuovere il surnatante dal pellet utilizzando una pipetta da 10 millilitri. Inoltre, rimuovere il supporto rimanente utilizzando una pipetta P 200.
Quindi, risospendere il pellet colonoide aggiungendo 75 microlitri di mezzo monostrato murino. Erogare 75 microlitri della sospensione di colonoide al centro di ciascun inserto di coltura cellulare. Pipettare delicatamente la sospensione una o due volte prima di aggiungerla al pozzetto per garantire una placcatura uniforme.
Posizionare la piastra a 24 pozzetti con inserti di coltura cellulare su una piattaforma rotante per 10 minuti per consentire una dispersione uniforme attraverso l'inserto di coltura cellulare, prima di posizionare la piastra in un incubatore sterile a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. Alla fine dell'incubazione, rimuovere i frammenti di colonoidi non attaccati posizionando la punta accanto all'interno della coltura cellulare e pipettare il terreno da tre a cinque volte con una pipetta P 200. Evitare di interrompere le cellule intestinali attaccate.
Rimuovere immediatamente la miscela di mezzo e colonide. Ripetere l'operazione fino a quando tutti gli inserti di coltura cellulare sono stati puliti. Ora aggiungi 150 microlitri di mezzo monostrato murino preriscaldato sul lato apicale di ciascun inserto di coltura cellulare.
Aggiungere 400 microlitri di mezzo monostrato murino riscaldato a ciascun pozzetto di una nuova piastra da 24 pozzetti. Trasferire l'inserto di coltura cellulare sulla nuova piastra afferrando la sua punta usando una pinza sterile. Cambiare il mezzo a giorni alterni fino a raggiungere la confluenza desiderata.
I colonoidi enzimaticamente interrotti placcati sugli inserti di coltura cellulare sono apparsi inizialmente in cluster cellulari che vanno da 15 a 150 cellule. Il terzo giorno, le cellule si sono appiattite e hanno coperto lentamente l'inserto della coltura cellulare, raggiungendo generalmente la confluenza. Nei due giorni successivi, i monostrati hanno continuato a crescere e hanno formato una barriera continua che può essere misurata quantitativamente.
