Dopo aver isolato i singoli nuclei dai tessuti congelati dei mammiferi, forare con cautela la lamina rotonda sulla cartuccia del dissociatore utilizzando il puntale di una pipetta. Per facilitare la pulizia del gradiente di saccarosio, rimuovere 900 microlitri della sospensione di nuclei dalla cartuccia e aggiungerli a 500 microlitri di soluzione a cuscino di saccarosio o SCS preparata in una provetta da due millilitri. Mescolare bene pipettando fino ad ottenere un composto omogeneo.
Quindi, tenere la provetta inclinata e aggiungere con cautela 1.400 microlitri di miscela SCS in sospensione di nuclei goccia a goccia su 500 microlitri di SCS, creando una separazione di fase chiaramente visibile. Chiudere con cautela il tubo e riposizionarlo sul ghiaccio senza disturbare la separazione di fase. Centrifugare con cura le provette a 13.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius in una centrifuga preraffreddata.
Rimuovere il surnatante senza disturbare la tavolozza e risospendere con cura la tavolozza in 50 microlitri di NSR ghiacciato. Estrarre le due tavolozze dello stesso campione in una nuova provetta da 1,5 millilitri. Aggiungere 900 microlitri di NSR ghiacciato a un volume totale di un millilitro e mescolare bene pipettando.
Centrifugare il campione a 500 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius con una centrifuga a rotore a secchiello oscillante. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 100 microlitri di PBS. Per il conteggio, diluire 10 microlitri di sospensione di nuclei in 20 microlitri di PBS.
Aggiungere 25 microlitri di soluzione colorante allo ioduro di propidio in un pozzetto di miscelazione della piastra contapezzi fluorescente. Quindi aggiungere 25 microlitri di sospensione di nuclei diluiti e mescolare bene mediante pipettaggio. Trasferire 50 microlitri del campione colorato dal pozzetto di miscelazione al pozzetto di carico.
Caricare la piastra di conteggio sul contatore di celle e avviare il conteggio. Dopo il conteggio, diluire i campioni con PBS alla concentrazione desiderata per il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo. Utilizzando il protocollo di isolamento dei nuclei parzialmente automatizzato, sono stati ottenuti nuclei di buona qualità senza segni di blabbing, detriti o grumi.
Vengono mostrati i grafici a violino che rappresentano la distribuzione della conta genica, della conta UMI e del contenuto mitocondriale in ciascun campione. Sono stati identificati i tipi di cellule attesi da ciascun tessuto e tutti gli animali hanno contribuito a tutti i cluster, indicando una bassa variabilità tecnica introdotta dal protocollo. Inoltre, le proporzioni cellulari, la conta UMI e la conta genica erano comparabili in tutti e tre i campioni per tipo di tessuto.
