Inizia tripsinizzando le cellule staminali mesenchimali umane per creare una sospensione cellulare. Successivamente, aliquotare la sospensione cellulare in un tubo da 1,5 millilitri per creare 10 costrutti. Dopo aver centrifugato la sospensione a 220 g per tre minuti, utilizzare una pompa a vuoto per rimuovere il surnatante.
Ora, posiziona il pellet cellulare sul ghiaccio. Successivamente, portare a temperatura ambiente l'acido ialuronico modificato con tioli, il reticolante tiolo-reattivo, il polietilenglicole diacrilato e le bottiglie d'acqua degassata. In condizioni sterili, utilizzare una siringa dotata di ago per aggiungere un millilitro di acqua degassata al flacone contenente acido ialuronico.
Agitare la soluzione, riscaldandola di tanto in tanto a 37 gradi Celsius fino a quando non diventa limpida. Quindi, metti la soluzione sul ghiaccio. In condizioni sterili, aggiungere 5 millilitri di acqua degassata al flacone reticolante.
Sciogliere capovolgendo ripetutamente prima di metterlo sul ghiaccio. Ora, aggiungere 120 microlitri della soluzione di acido ialuronico disciolto al pellet cellulare aliquotato e risospendere il pellet cellulare pipettando la soluzione avanti e indietro. Aggiungere 30 microlitri della soluzione reticolante disciolta nella provetta con il pellet cellulare risospeso.
Assicurarsi che la corretta miscelazione picchietti sul tubo. Dopo aver mescolato, centrifugare brevemente la soluzione. Far cadere 15 microlitri della soluzione combinata su una piastra da 24 pozzetti rivestita in paraffina.
Lasciare solidificare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Per la differenziazione in vitro, aggiungere 0,5 millilitri di terreno di differenziazione condrogenica agli idrogel seduti nelle cellule. Dopo tre settimane, passare al mezzo di differenziazione ipertrofica, aggiungendo 0,5 millilitri per pozzetto.
La differenziazione condrogenica ha portato a glicosaminoglicani solfatati nella matrice extracellulare positiva al collagene di tipo 2 sia nell'acido ialuronico o HA che nei costrutti di collagene. Tuttavia, la distribuzione era più omogenea nei costrutti di acido ialuronico. I costrutti di collagene hanno dimostrato cellule periferiche con morfologia eterogenea.
La rotondità media delle cellule nei costrutti HA era superiore a quella dei costrutti di collagene. La deposizione di calcio è stata rilevata ai bordi esterni di entrambi i costrutti a cinque settimane. Nei costrutti di acido ialuronico in vivo, tutti gli impianti sono stati attaccati l'uno all'altro in tasche sottocutanee e hanno formato tessuto osseo integrato.
Il 40% dei costrutti di collagene in vivo erano indipendenti. Il tessuto osteoide con morfologia lamellare si è formato nelle regioni esterne di entrambi i costrutti in vivo a otto settimane dall'impianto. La perdita di cartilagine è stata osservata anche nel costrutto HA.
Più costrutti di HA in vivo sembravano formare tessuto osseo integrato, come indicato dalla connessione ai tessuti ossei e dalla presenza di tessuto fibroso articolare. Mentre il 40% dei costrutti di collagene erano uniti, i costrutti rimanenti esistevano separati o erano attaccati solo senza connessioni di tessuto osseo. Entrambi i costrutti mostravano vasi marcati positivamente nel midollo osseo e la cartilagine interna era circondata da cellule osteoclastiche multinucleate.
Il minerale è stato depositato nella regione osteoide esterna di entrambi i costrutti con volume minerale più elevato e dei costrutti HA a causa delle loro dimensioni maggiori.
