Inizia estraendo il DNA genomico dalle foglie di bambù selvatiche e infette da Agrobacterium. Amplificare il DNA genomico contenente il sito bersaglio dei geni bersaglio da foglie di bambù selvatiche e infette da Agrobacterium utilizzando le seguenti condizioni PCR. Dopo la PCR, eseguire la digestione dell'enzima endonucleasi preparando una miscela di reazione contenente un microlitro di età-1, un microgrammo di prodotti PCR e un tampone 10X da cinque microlitri.
Quindi, aggiungere acqua fino a un volume finale di 50 microlitri. Incubare la miscela di digestione a 37 gradi Celsius per un'ora. Utilizzando l'elettroforesi su gel, analizza la proporzione di frammenti di DNA digeriti.
Confronta i frammenti digeriti dai campioni wild-type e infetti da Agrobacterium per valutare l'efficienza dell'editing genetico. Esporre le piantine di bambù a condizioni di alta intensità luminosa per aumentare la quantità di luce assorbita e l'attivazione del sistema di fotoprotezione fogliare. Quindi, accendi il fluorimetro IMAGING-PAM e imposta l'intensità della luce attinica per misurare in vivo la fluorescenza della clorofilla del fotosistema II delle foglie di bambù.
Il colore rosso della corsia beta prodotta dal gene RUBY ha indicato un'espressione genica mediata da Agrobacterium nelle foglie di bambù. Dei quattro ceppi di Agrobacterium, il ceppo GV3101 ha causato l'accumulo più significativo di corsia beta nelle foglie di bambù infette. Dopo l'infezione con i costrutti CRISPR-Cas9 e i trattamenti ad alta luce, alcune aree delle lame fogliari hanno mostrato valori di tempra non fotochimica inferiori.
Inoltre, l'analisi della digestione enzimatica e del sequenziamento ha confermato il successo della mutazione del gene PeVDE nelle regioni modificate. I risultati del sequenziamento con metodo Sanger del frammento PeVDE dopo l'editing sia da parte di sgRNA1 che di sgRNA2 hanno mostrato la delezione di un frammento lungo nel gene PeVDE. Dopo 30 giorni di infezione da Agrobacterium, le aree fogliari trasfettate con sgRNA sia per PeVDE che per PeCCR5 hanno mostrato valori di tempra non fotochimica inferiori.
