Dopo aver costruito e allineato il sistema di microscopio a due fotoni sensibile alla polarizzazione, in base alla rappresentazione schematica visualizzata, testare la qualità dell'allineamento dell'ottica con un campione di riferimento isotropo come la fluoresceina incorporata in un polimero amorfo. Per fare ciò, accendere il laser di eccitazione e misurare i grafici polari a 360 gradi del campione di riferimento per una piastra a semionda zero. Regolare l'angolo della piastra a semionda in modo che corrisponda agli assi X e Y del piano di campionamento e verificare se entrambi i fotodiodi raccolgono intensità simili di due componenti di emissione eccitate da fotoni.
Per analizzare il campione, montare il vetrino con questo campione di sferulite sul tavolino piezoelettrico, assicurandosi che la faccia del vetrino contenente il vetrino coprioggetto sia rivolta verso l'obiettivo ad immersione ad alta apertura numerica. Quindi fissare il vetrino con del nastro adesivo. Successivamente, regolando le posizioni X, Y e Z utilizzando le manopole del microscopio, mettere a fuoco l'obiettivo sulla sferulite nella soluzione.
Concentrati in particolare sull'area centrale dell'intera struttura, poiché i diametri della sferulite sono solitamente nell'ordine delle decine di micron. Quindi centrare questa sferulite nel campo visivo sul piano del microscopio. Determinare la dimensione della scansione XY regolando il numero di gradini dello stadio piezoelettrico nelle direzioni X e Y per coprire l'intera area della struttura.
Regola i parametri dello stadio piezoelettrico come la velocità di scansione, la dimensione del passo e la portata per coprire l'area dell'intera sferulite. Aprire l'otturatore, accendere i fotodiodi e raccogliere le componenti di emissione X e Y dell'intensità di fluorescenza eccitata a due fotoni per ogni singolo passo dell'area di scansione selezionata per il fascio di eccitazione polarizzato corrispondente agli assi X e poi Y. Quindi scansiona questo campione di sferulite, ottenendo una fluorescenza eccitata a due fotoni.
Per eseguire l'analisi di polarizzazione completa dal punto specifico del campione, spegnere il fascio di eccitazione. Prendi le coordinate specifiche dello stadio piezoelettrico corrispondenti alla posizione scelta su questa sferulite in cui sono richieste le informazioni sull'orientamento delle molecole con la risoluzione submicrometrica. Regolare il tavolino piezoelettrico per centrare il campo visivo alle coordinate X e Y indicate.
Dopo aver acceso il fascio di eccitazione, attivare la rotazione di 180 gradi della piastra a semionda per eseguire un'analisi di polarizzazione completa a 360 gradi delle componenti di emissione X e Y dell'emissione di fluorescenza eccitata a due fotoni. L'immagine della sferulite di insulina ottenuta dopo l'esecuzione di una scansione raster 2PFM era coerente con quelle riportate per una sferulite. È stata inoltre verificata la posizione della piastra a semionda corrispondente all'eccitazione del campione lungo gli assi X e Y.
I grafici polari sono cambiati durante l'esecuzione di un'analisi di polarizzazione completa da diversi punti selezionati. Al di fuori della sferulite, il grafico PLO appariva come un insieme di artefatti e picchi casuali di rumore del segnale. I poligrafi correttamente misurati da posizioni altamente ordinate lungo gli assi X e Y avevano forme e geometrie diverse a seconda dell'orientamento locale e dell'organizzazione dei fluorofori.
