Preparation of FFPE DNA and RNA Samples for Sequencing Using an Automated Purification Instrument (API)

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02:34 min

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September 8th, 2023

DOI :

10.3791/200724-v

September 8th, 2023

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Christophe Bontoux¹^,²^,³^,⁴^,⁵, Virginie Lespinet-Fabre¹^,²^,³^,⁴, Olivier Bordone¹^,²^,³^,⁴, Virginie Tanga¹^,²^,³^,⁴, Maryline Allegra¹^,²^,³^,⁴, Myriam Salah¹^,²^,³^,⁴, Salomé Lalvée¹^,²^,³^,⁴, Samantha Goffinet¹^,²^,³^,⁴, Jonathan Benzaquen³^,⁴^,⁵^,⁶, Charles-Hugo Marquette³^,⁴^,⁵^,⁶, Marius Ilié¹^,²^,³^,⁴^,⁵, Véronique Hofman¹^,²^,³^,⁴^,⁵, Paul Hofman¹^,²^,³^,⁴^,⁵

¹Laboratory of Clinical and Experimental Pathology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d’Azur, CHU de Nice, ²Hospital-Integrated Biobank (BB-0033-00025), Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, ³Institut Hospitalo-Universitaire (IHU), RespirERA, Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, ⁴FHU OncoAge, Université Côte d'Azur, ⁵Team 4, Institute of Research on Cancer and Aging (IRCAN), CNRS INSERM, Centre Antoine-Lacassagne, Université Côte d'Azur, ⁶Department of Pulmonary Medicine and Thoracic Oncology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d'Azur

Trascrizione

Per iniziare, tagliare i campioni di DNA e RNA fissati in formalina e incorporati in paraffina o FFPE. Attiva la purificazione automatica o lo strumento API e accedi con il nome utente e la password. Successivamente, nel software Integrated Genomic Viewer, in campioni, fare clic su Crea campioni"immettere il nome del campione e selezionare la categoria dell'applicazione.

Dopo aver inserito i dettagli del campione, fare clic su Salva"Quindi selezionare Esecuzioni"fare clic su Campione da risultare"e immettere il nome dell'esecuzione prima di fare clic su Avanti"Selezionare il test seguito da un campione di interesse e fare clic su Avanti"Dopo aver selezionato ciascun campione, fare clic su Assegna"quindi controllare i parametri di eluizione e salvare l'esecuzione. Posizionare i campioni di tessuto FFPE e le provette per il trattamento dei campioni. Centrifugare la provetta a 2.000 g per un minuto.

Aggiungere la miscela master Protease Digest preparata da un kit di purificazione degli acidi nucleici nella provetta. Incubare il campione a 60 gradi Celsius per un'ora, quindi incubarlo a 90 gradi Celsius per un'ora. Dopo aver raffreddato i campioni, sollevare la camera d'aria del tubo di lavorazione dei campioni e bloccarla ruotandola a sinistra.

Centrifugare la camera d'aria a 2.000 g per 10 minuti. Quindi sbloccare il tubo girando a destra e separandolo dall'altro tubo. Scartare la camera d'aria e posizionare la camera d'aria esterna sul ghiaccio fino al caricamento sull'API.

Preparare una miscela master per la digestione del DNA e caricare la piastra due preriempita per la purificazione del DNA e dell'RNA FFPE. Caricare i campioni preparati nella piastra di purificazione del DNA e dell'RNA FFPE uno. Nella schermata API, fare clic su Esegui"quindi selezionare il piano di esecuzione e fare clic su Avanti"Seguire le istruzioni sullo schermo per caricare i materiali di consumo e i reagenti necessari per il ciclo di purificazione.

Una volta caricati tutti i reagenti, fare clic su Avanti"chiudere lo sportello dell'API e fare clic su Avvia"Alla fine della corsa, fare clic su Scarica"e rimuovere immediatamente la piastra di archivio dell'acido nucleico a 48 pozzetti contenente il DNA e l'RNA purificati. Al termine della purificazione del campione, sigillare la piastra e conservarla a meno 80 gradi Celsius.

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