Metodo in una e due fasi di isolamento dei neutrofili di ratto per la raccolta di trappole extracellulari di neutrofili (NET)

Per iniziare il prelievo del midollo osseo, immergere un ratto soppresso in etanolo al 75% per sterilizzare il pelo e la pelle. Appoggia il ratto sulla schiena e recisci gli arti inferiori all'altezza dell'anca per proteggere la testa del femore. Usa le forbici da dissezione per tagliare il legamento all'articolazione del garretto.

Quindi piegare l'articolazione del ginocchio all'indietro per esporre il femore e la tibia. Con un paio di pinze e forbici, rimuovi con cura eventuali muscoli, tendini e altri tessuti collegati alle ossa. Infilare il midollo attraverso entrambe le estremità ossee con una siringa agugliata da 5 millimetri per allentare la matrice del midollo.

Ora usa una siringa nuova per risciacquare il midollo osseo con 10-15 millilitri di terreno RPMI. Centrifugare le cellule del midollo osseo a 300 G per 10 minuti a 20 gradi Celsius. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 5-10 millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi.

Dopo aver incubato la sospensione, aggiungere quattro volte il volume di HBSS alla miscela. Quindi centrifugare le celle a 600 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Utilizzare il pellet risultante per un ulteriore utilizzo.

Isolare prima i neutrofili con il kit di isolamento dei neutrofili del midollo osseo di ratto. Stratificare 2 millilitri di reagente all'80-55% per col in una provetta da centrifuga da 15 millilitri, per creare un gradiente di densità. Quindi pipettare i neutrofili isolati, o la soluzione di risospensione di cellule isolate con il kit di isolamento dei neutrofili del midollo osseo di ratto, nella provetta.

Centrifugare la provetta a 800 G per 40 minuti a 20 gradi Celsius. Con una pipetta sterile, raccogliere lo strato di gradiente del 70%, compresi gli strati cellulari al limite del 65-70%. Trasferire la sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga da 15 millilitri.

Aggiungere 15 millilitri di HBSS nel tubo e capovolgere delicatamente per mescolarne il contenuto. Infine, centrifugare la provetta a 300G per 10 minuti a temperatura ambiente per pellettare le cellule. Per il processo in un'unica fase, dopo aver pipettato la sospensione del midollo osseo direttamente nella provetta a gradiente di densità, centrifugare come dimostrato in precedenza.

Quindi, pipettare lo strato di gradiente del 70%, compresi gli strati al limite del gradiente del 75-70%. Trasferire questa sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga da 50 millilitri con 10 millilitri di HBSS. Quindi centrifugare la provetta a 400 G per cinque minuti a temperatura ambiente per pellettizzare le cellule.

Contare i neutrofili isolati utilizzando un emocitometro e valutare la vitalità cellulare tramite la colorazione blu tripano. Il metodo in due fasi ha avuto un livello di purezza superiore del 90% rispetto al 50% ottenuto dal metodo in una fase.