Per iniziare, versare 100 millilitri di acqua distillata in un bicchiere contenente 4 grammi di zucchero e 0,8 grammi di agar. Scaldare il composto a 100 gradi Celsius mescolando continuamente. Togliete il composto dal fuoco per farlo raffreddare.
Abbassa la fiamma per mantenere una temperatura di 80 gradi Celsius. Quindi, aggiungi 7,4 grammi di farina, seguiti da 2,8 grammi di lievito al composto mescolando. Quindi, aggiungi la soluzione di acido propionico Moldex nella miscela, quindi raffredda la temperatura a 50 gradi Celsius.
Aggiungere la soluzione di estratto vegetale di psidium guajava seguita da 0,5 grammi di polvere blu di bromofenolo. Versare la miscela di cibo preparata nelle piastre di Petri fino a riempire ogni piatto. Dopo che i piatti si sono raffreddati a temperatura ambiente, sigillarli con i coperchi e conservarli in frigorifero a 4 gradi Celsius.
Per preparare le fiale per il test, preparare prima i serbatoi di anidride carbonica, la pistola ad aria compressa con aghi, il tappetino per mosche, il pennello e il microscopio per maneggiare le mosche. Selezionare fiale contenenti almeno 10 pupe di Drosophila per standardizzare l'età delle mosche. Per rimuovere le mosche adulte, capovolgere i flaconcini e inserire un ago tra il tappo di cotone e la parete laterale del flaconcino.
Anestetizzare le mosche adulte usando la cerbottana ad anidride carbonica fino a quando non sono incoscienti sul tappo di cotone. Aprire il flaconcino sopra una bottiglia di vetro contenente il 70% di etanolo e lasciarvi cadere le mosche. Sigillare il flaconcino con il tappo di cotone.
Quindi, incubatelo a 25 gradi Celsius con il 60% di umidità e un ciclo di luce di 12 ore di luce e 12 ore di buio. Successivamente, suddividi le mosche in femmine e maschi vergini con l'aiuto di un microscopio entro otto ore dall'incubazione per prevenire l'accoppiamento. I genitali femminili possono essere identificati dal loro colore pallido mentre i genitali maschili hanno una tonalità rossastra.
I maschi possono anche essere riconosciuti dai pettini sessuali sulle zampe anteriori. Dividere le mosche selezionate in due provette fresche, una per ogni sesso, e incubarle per 6-8 giorni a 25 gradi Celsius. Inizia impilando le piastre di Petri etichettate una sopra l'altra.
Capovolgere le piastre di Petri con il cibo colorato su carta assorbente per assorbire il liquido in eccesso. Quindi, usa una spatola per dividere il cibo in ogni piatto in 12 segmenti uguali. Trasferisci una fetta di cibo in una capsula di Petri vuota.
Successivamente, anestetizzare le mosche usando l'anidride carbonica fino a quando non si addormentano sul tappo di cotone. Trasferisci con cura sei mosche sane in ogni capsula di Petri. Mettere le piastre sigillate in un'incubatrice.
Per evitare che le mosche scappino durante l'esperimento, fissare i coperchi superiore e inferiore di ciascuna capsula di Petri con del nastro adesivo. Dopo un periodo di allevamento di 24 ore, anestetizzare nuovamente le mosche utilizzando anidride carbonica. Quindi, trasferire le mosche in un contenitore riempito con etanolo al 70% per lo smaltimento.
Inoltre, scartare eventuali residui di cibo dai piatti. Per facilitare la quantificazione delle piastre di Petri, avviare il software Epson Scan 2, assegnare un nome al file ed eseguire una scansione di anteprima. Scansiona singolarmente sia il coperchio superiore che quello inferiore di ciascuna capsula di Petri.
Ritaglia con cura la scansione delle immagini con un editor di immagini open source per eliminare eventuali artefatti e residui di cibo, quindi salva l'immagine ritagliata come file TIFF. Quindi, avvia il software T.U.R.D. Fare clic su File per creare un nuovo documento dell'esperimento, assegnargli un nome e salvarlo nella sottocartella Analisi.
Fare clic sull'opzione Piastre e quindi selezionare Aggiungi piastra per scegliere la piastra di Petri per l'analisi. Apparirà una nuova finestra che mostra i nomi delle piastre selezionate insieme alle nuove impostazioni dei parametri. Impostare la dimensione del blocco su 21, l'offset su 5, la dimensione minima su 20 e la dimensione massima su 600.
Per confermare l'accuratezza del rilevamento dei depositi fecali, passare a Piastre, quindi fare clic su Ispeziona piastre selezionate seguito da Grafica e Visualizza immagini annotate. Ingrandisci le immagini per rivedere i conteggi dei depositi. Se necessario, deselezionare i depositi che non devono essere inclusi nell'analisi.
A seguito dell'analisi con il software T.U.R.D., regolare il numero di mosche cliccando sul numero di mosche. Modificare il nome del gruppo facendo clic su Platee, quindi su Modifica gruppi, quindi premere Aggiungi. Selezionare il nome del gruppo appropriato nella colonna Gruppo.
Quindi, fai clic su Analizza, seguito da Statistiche descrittive e seleziona Raggruppa per esportare i dati per ogni replica separatamente. Salva tutti i file del foglio di calcolo risultanti nella stessa cartella designata. Per compilare tutti i dati in un unico foglio di calcolo, aprire l'applicazione Excel Merge v4.
Quando viene richiesto di selezionare il percorso della cartella con i file CSV, immettere l'indirizzo della cartella e premere Invio due volte per creare un nuovo foglio di calcolo nella stessa cartella. Aggiungi un nuovo foglio nel foglio di calcolo con i dati uniti per calcolare la media di ciascun parametro in tutte le repliche. Utilizzare la funzione CERCA.VERT per raccogliere la media di ciascun parametro di tutte le repliche.
Avvia il software GraphPad Prism e inserisci i nomi dei set di dati. Trasferisci i dati dal foglio di calcolo di Excel al grafico dei dati di Prism. Fare clic su Analizza per scegliere i set di dati da analizzare e premere OK. Scegli i parametri di prova appropriati, analizza il valore P.
Il numero di depositi fecali, l'area totale dei depositi e l'IOD erano significativamente più alti nel gruppo alimentare normale rispetto all'estratto di P.guajava sia nei maschi vergini che nelle femmine. Il monitoraggio del consumo di alimenti solidi ha mostrato che non c'erano differenze significative nel consumo di cibo tra i gruppi forniti dal farmaco e quelli non forniti dal farmaco. Tuttavia, i moscerini maschi che hanno consumato loperamide sembravano assumere meno cibo del normale.
