Per iniziare, prendi colture di Pseudomonas aeruginosa coltivate per 24 ore. Quindi impostare la sua densità ottica a 600 nanometri a 0,2 ed effettuare diluizioni adeguate utilizzando soluzione salina allo 0,8%. Con un anello di filo sterile, strisciare la coltura batterica sulla piastra di agar CAS.
Incubare la piastra di agar CAS a 30 gradi Celsius per 24 ore. Trasferire la coltura su una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti e misurare la densità ottica a 600 nanometri. Successivamente, trasferire le colture in provette da centrifuga.
Centrifugare la coltura batterica a 4650 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Pipettare 100 microlitri di surnatante privo di cellule e aggiungerlo a un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Quindi aggiungere 100 microlitri di colorante CAS nel pozzetto.
Coprire la piastra con un foglio di alluminio prima dell'incubazione. Dopo l'incubazione, effettuare letture spettrofotometriche a 630 nanometri e calcolare la quantità totale di siderofori come unità siderofora percentuale. Pipettare 100 microlitri del surnatante senza cellule in una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti.
Quindi aggiungere 100 microlitri di acido tris-cloridrico. Misurare la lettura spettrofotometrica della soluzione a 405 nanometri. Per l'estrazione della piochelina, per prima cosa, pipettare 100 millilitri di colture di Pseudomonas aeruginosa coltivate per 48 ore in provette da centrifuga.
Centrifugare le colture a 4650 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere cinque millilitri di acido citrico molare al surnatante. Aggiungere 50 millilitri di acetato di etile alla soluzione per estrarre la piochelina.
Filtrare la fase organica con solfato di magnesio attraverso un filtro a siringa. Quindi conservare la fase organica a meno 20 gradi Celsius. Infine, effettuare letture spettrofotometriche a 320 nanometri.
I tre isolati clinici e il ceppo di riferimento, PAO1, hanno sviluppato un alone arancione chiaro quando sono stati coltivati su agar CAS, indicativo della produzione di siderofori. Sono state osservate differenze significative tra la produzione totale di siderofori dell'isolato J3 e PAO1. Le analisi spettrofotometriche dell'estratto di pioverdina hanno presentato un picco di conferma a 380 nanometri.
Mentre tutti gli isolati sono risultati positivi per la produzione di pioverdina, MR1 e J3 hanno mostrato una produzione inferiore rispetto al ceppo di riferimento. La presenza di piochelina è stata confermata da un picco a 320 nanometri. Tutti e tre gli isolati clinici hanno prodotto volumi significativamente più elevati rispetto a PAO1.
