Per iniziare, aggiungere una soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% alle cellule HeLa e incubare a 37 gradi Celsius per due o tre minuti. Dissociare delicatamente le cellule pipettandole e seminarle in nuove piastre con un rapporto di uno a quattro per il passaggio cellulare. Per trasfettare il plasmide in cellule HeLa, miscelare un microgrammo di plasmide sgRNA PX458 convalidato, con 50 microlitri di terreno sierico ridotto in provetta A.In provette B, mescolare delicatamente due microlitri del reagente di trasfezione e 50 microlitri di terreno sierico ridotto e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.
Quindi, unire il contenuto delle provette A e B e incubare a temperatura ambiente per altri cinque minuti. Aggiungere la miscela alla piastra a 12 pozzetti e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per sei ore. Al termine dell'incubazione, sostituire il terreno con terreno DMEM fresco.
Dopo 24 o 48 ore, valutare l'efficienza di trasfezione esaminando le cellule HeLa al microscopio a fluorescenza. Dissociare completamente le cellule HeLa trasfettate utilizzando EDTA allo 0,25% di tripsina e incubare a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti. Successivamente, contare le cellule utilizzando una camera di Neubauer o un contatore di cellule automatizzato.
Placcare le cellule in tre piastre separate da 96 pozzetti per ciascuna popolazione trasfettata seguendo metodi di diluizione seriale. Rimettere le cellule in un'incubatrice umidificata per una o due settimane. Per lo screening basato sul fenotipo e la convalida del knockout di CENP-E, dissociare ed espandere le cellule in piastre da 24 o 12 pozzetti per cinque-sette giorni.
Eseguire lo screening delle cellule mutanti con diametri di colonia più piccoli utilizzando un microscopio invertito con lenti dell'obiettivo con ingrandimento 10x e 20x. Successivamente, raccogli le cellule per l'estrazione del DNA utilizzando il kit di estrazione del DNA genomico animale su colonna seguendo le istruzioni del produttore e imposta le reazioni a catena della polimerasi. Legare il DNA bersaglio nel vettore pMD18-T come indicato dai protocolli del produttore.
Trasfettare il plasmide legato in cellule DH5-Alpha competenti e procedere con la coltura per la selezione del clone. Per identificare i tipi di knockout CENP-E, isolare il DNA plasmidico con l'aiuto di un kit di estrazione plasmidica seguendo le linee guida del produttore. Successivamente, eseguire il sequenziamento Sanger per il DNA plasmidico di ciascuna colonia utilizzando primer M13 diretti e inversi.
Semina le cellule HeLa wild type e mutanti CENP-E su vetrini di copertura da 12 millimetri in una piastra da 24 pozzetti. Rimuovere il terreno DMEM completo e fissare le cellule utilizzando una soluzione di paraformaldeide al 4% e PBS a temperatura ambiente per 10 minuti. Successivamente, colorare i nuclei con DAPI a temperatura ambiente per cinque minuti.
Osservare e convalidare le cellule mutanti CENP-E in base al fenotipo di allineamento cromosomico utilizzando un microscopio a fluorescenza. Lo screening fenotipico delle colonie ha mostrato che le cellule knockout CENP-E hanno mostrato un aumento del disallineamento cromosomico rispetto al gruppo di controllo.
