Per iniziare, aggiungere 150 microlitri di tampone di marcatura nelle provette del campione contenenti i campioni di mioblasti di topo marcati. Pipettare EDTA, SDS e proteinasi K in ciascuna provetta. Agitare il contenuto delle provette per mescolarlo bene, quindi incubare le provette a 55 gradi Celsius per due ore in una macchina per PCR.
Quindi, pipettare ogni campione in provette da centrifuga da 1,5 millilitri contenenti 200 microlitri di miscela fenolo-cloroformio. Agitare il contenuto dei tubi per mescolarli. Una volta completata la centrifugazione, trasferire lo strato superiore in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 millilitri.
Quindi aggiungere 200 microlitri di cloroformio nelle nuove provette prima di vorticare e centrifugare nuovamente. Aspirare lo strato superiore in un nuovo tubo. Ora aggiungi 550 microlitri di etanolo al 100% in ogni provetta del campione e mescola bene invertendolo.
Quindi posizionare le provette a meno 80 gradi Celsius per un'ora per indurre la precipitazione del DNA. Centrifugare la soluzione alla massima velocità per 15 minuti per ottenere un pellet di DNA. Dopo aver versato il surnatante, lavare il pellet con etanolo al 75% prima di centrifugare nuovamente per cinque minuti.
Quindi risospendere il pellet in 21 microlitri di acqua bidistillata. Impostare la PCR da utilizzare per la preparazione della libreria. Utilizzare un primer Illumina N7XX diverso per ogni campione e un primer N5XX universale.
Inserire il numero del ciclo PCR nello strumento per eseguire la PCR. Dopo l'amplificazione, elettroforare tre microlitri delle librerie su gel di agarosio. Le librerie CUT&Tag contenevano per lo più mononucleosomi marcati di circa 300 coppie di basi.
La qPCR ha dimostrato che il marcatore H3K4me1 era altamente arricchito nelle regioni enhancer del gene MYOD1.
