Per iniziare, aggiungi 500x colorante arancione a una soluzione PBS per ottenere diversi rapporti di colorante, avvia il software di acquisizione dati sul desktop. Fare clic su Strumento, quindi scegliere il modello di micropiastra corrispondente e selezionare OK. Fare clic su Impostazioni di acquisizione e scegliere Fluorescenza.
Nell'interfaccia della lunghezza d'onda, impostare la lambda su 470 nanometri e 570 nanometri, quindi premere OK. Pipettare 100 microlitri di ogni concentrazione del colorante arancione nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Posizionare la piastra nel tavolino di rilevamento dello strumento lettore di micropiastre fluorescente.
Fare clic sull'icona Leggi sul software e misurare la fluorescenza di ciascuna concentrazione di colorante 13 volte a temperatura ambiente con un intervallo di due minuti. Dopo ogni determinazione, fare clic sull'icona Esporta, quindi selezionare Esporta in XML XLS TXT. Scegliere Tutte le piastre.
Quindi selezionare Piastra nel formato di output e fare clic su OK per salvare i dati nel formato XLS per ulteriori analisi. Ora, accendi il riscaldamento digitale agitando il bagno a secco. Impostare la temperatura di riscaldamento su 35 gradi Celsius e il tempo di riscaldamento su due minuti.
Preparare il rapporto di diluizione ottimale del colorante in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi metterlo nel bagno asciutto con riscaldamento digitale per due minuti. Ora, aggiungere 100 microlitri di PBS e soluzioni coloranti ai pozzetti della piastra.
Posizionare la piastra nel tavolino di rilevamento dello strumento. Fare clic sull'icona Leggi nel software di acquisizione dati. Impostare la temperatura di riscaldamento su 40 gradi Celsius e il tempo di riscaldamento su due minuti.
A questo punto, pipettare nuovamente la soluzione colorante nella piastra nella provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Scaldarlo nel bagno asciutto riscaldante digitale per due minuti. Ripetere l'aggiunta delle soluzioni coloranti, esportando i dati risultanti per testare l'assorbanza della soluzione colorante con incrementi di temperatura di cinque gradi da 35 a 95 gradi Celsius.
Combina la soluzione proteica CD40 con PBS per ottenere concentrazioni finali di 5, 10, 15 e 20 microgrammi per microlitri. Successivamente, combina il colorante arancione con il PBS per ottenere una concentrazione finale di uno è a 500. Valutare l'assorbanza della soluzione proteica CD40 con incrementi di temperatura di cinque gradi da 35 a 95 gradi Celsius.
Salva i dati come file XLS, quindi calcola il punto di fusione o il valore TM utilizzando il software di analisi dei dati. Successivamente, miscelare CD40 e umbelliferone nella soluzione PBS. Quindi pipettare il colorante arancione nel PBS per ottenere una concentrazione di soluzione di uno a 500.
Misurare l'assorbanza della soluzione di complessi CD40 Umbelliferone con incrementi di temperatura di cinque gradi da 35 a 95 gradi Celsius. Il colorante arancione ha costantemente mostrato un'eccitazione stabile della fluorescenza sia a temperatura ambiente che a temperature elevate. È stato determinato un rapporto di diluizione ottimale di uno a 500.
Un valore di TM stabile di 51,82 gradi Celsius è stato rilevabile a una concentrazione di 15 microgrammi per millilitri, che è diminuito a 45,79 gradi Celsius con un aumento della concentrazione della proteina CD40.
