Proteine precipitate con tag epitopo a rilascio e immunoblotting per studi di interazione proteina-proteina

Centrifugare il campione di proteina etichettato con epitopo a 5.000 G per 30 secondi a 4 gradi Celsius. Attendere un minuto sul ghiaccio per consentire alle perline di livellarsi. Quindi scartare il surnatante.

Aggiungere un millilitro di tampone di lisi proteica contenente inibitore della proteasi nella provetta e mescolare il contenuto. Ruotare il tubo su un rotatore per cicli di circa 30 secondi a 4 gradi Celsius per cinque minuti. Centrifugare di nuovo e mettere la provetta sul ghiaccio per un minuto per livellare le perle prima di scartare il surnatante.

Ora, aggiungi 10 microlitri di tampone campione e fai bollire il campione a 98 gradi Celsius per 10 minuti. Centrifugare il campione a 5.000 G per 30 secondi a 4 gradi Celsius. Posizionare una colonna in una nuova provetta a basso assorbimento proteico e trasferire il gel in una colonna utilizzando una pipetta con punta tagliata.

Centrifugare a 9, 730 G per un minuto a 4 gradi Celsius e raccogliere il flusso. Posizionare il gel nella camera di elettroforesi e aggiungere il tampone tris-glicina-SDS fino al volume appropriato intorno al gel. Caricare i campioni di proteine eluite su un gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato.

Eseguire l'elettroforesi a 100 volt e 400 milliampere. Trasferire il gel su una membrana di fluoruro di polivinilidene e tamponare la membrana con latte scremato al 5% per un'ora a temperatura ambiente. Lavare la membrana tre volte con monolaurato di poliossietilene sorbitano PBS su uno shaker alla massima velocità per cinque minuti.

Infine, incubare la membrana con l'anticorpo primario per una notte su uno shaker a 4 gradi Celsius. Nelle cellule HEK 293 trasfettate, l'immunoblotting ha confermato l'associazione tra DYKDDDDK-PRDDM16 e HA-EHMT1 in gruppi trasfettati con DYKDDDDK-PRDDM16 e HA-EHMT1.