Purificazione del prodotto di legatura, amplificazione e purificazione della libreria per la rilevazione di SNP multigenico nel carcinoma gastrico

Per iniziare, rimuovi le perle magnetiche di purificazione del DNA dal frigorifero da due a otto gradi Celsius. Centrifugare le perle per 10 secondi a 2,500 G dopo la miscelazione. Trasferire il prodotto di reazione legato con adattatore in una provetta da microcentrifuga a basso assorbimento da 1,5 millilitri.

Aggiungere 45 microlitri di perline magnetiche purificate con DNA a ciascuna provetta. Dopo aver agitato i componenti, centrifugare la provetta per 10 secondi, quindi posizionare la provetta su una rastrelliera magnetica per tre minuti. Scartare con cura il surnatante senza pipettare le perline.

Ora trasferisci 300 microlitri di etanolo appena preparato al 75% in ogni provetta per microcentrifuga. Ruotare delicatamente i tubi quattro volte a 180 gradi. Una volta che la soluzione si è chiarificata, scartare prontamente il surnatante evitando di pipettare le perline.

Quindi centrifugare brevemente le provette dopo aver rimosso le provette dalla cremagliera magnetica. Posizionare le provette sulla griglia magnetica e pipettare il liquido rimasto. Aprire i tappi delle provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri e lasciare asciugare le perle a temperatura ambiente per cinque minuti.

Dopo aver scongelato e agitato i reagenti relativi alla PCR, centrifugare i reagenti per 10 secondi. Rimuovere la provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri dal rack magnetico e aggiungere i reagenti PCR. Centrifugare brevemente la provetta a vortice per evitare gocce di liquido sulla parete della provetta e sul coperchio.

Quindi trasferire il prodotto PCR in una nuova provetta PCR. Incubare su un termociclatore ed eseguire il programma di amplificazione per campioni di DNA e CDNA. Dopo l'incubazione, centrifugare la provetta per PCR per 10 secondi e trasferire il prodotto in una nuova provetta per microcentrifuga a basso assorbimento da 1,5 millilitri.

Aggiungere 25 microlitri di perline magnetiche purificate con DNA a ciascun tubo e mescolare bene con il vortex. Centrifugare la provetta a bassa velocità e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi posizionare le provette su una griglia magnetica per tre minuti fino a quando la soluzione non si chiarisce.

Trasferire il surnatante in nuove provette per microcentrifuga, evitando di pipettare le perline. Trasferire 300 microlitri di etanolo appena preparato al 75% nelle provette e lavare le perle due volte utilizzando una rastrelliera magnetica, come dimostrato in precedenza. Dopo aver centrifugato brevemente le provette, posizionarle sul rack e pipettare il liquido rimanente.

Aprire i tappi dei tubi da 1,5 millilitri e asciugare le perle a temperatura ambiente per cinque minuti. Pipettare 50 microlitri di eluente nelle provette. Eseguire una breve centrifugazione dopo aver agitato le provette.

Posizionare le provette su una griglia magnetica per tre minuti fino a quando la soluzione diventa limpida. Trasferisci con cura il liquido in un nuovo tubo ed etichettalo con il nome della libreria.