Per iniziare, ottenere cellule THP-1 differenziate e rimuovere il terreno esaurito dai pozzetti della piastra di coltura Dopo aver lavato le cellule con PBS, aggiungere alle cellule un terreno privo di siero contenente lipopolisaccaride, o LPS, e incubare la piastra. Quindi aggiungere l'adenosina trifosfato o la soluzione madre di ATP al gruppo modello e incubare la piastra per 45 minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Quindi, aspirare tutto il surnatante dai pozzetti della piastra di coltura.
Dopo aver lavato le cellule due volte con PBS, aggiungere 500 microlitri di tripsina allo 0,05% senza EDTA in ogni pozzetto e incubare per 30 secondi. Per fermare il distacco delle cellule, aggiungere un millilitro di terreno RPMI 1640 e trasferire le cellule in una provetta da cinque millilitri. Centrifugare la provetta a 300 G per tre minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver risospeso le cellule in un millilitro di PBS, posizionare la provetta con le cellule in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per tre minuti e centrifugare. Per risospendere le cellule, aggiungere 100 microlitri di tampone legante 1X e trasferire le cellule in una nuova provetta da cinque millilitri. Incubare le provette di controllo e il modello con reagenti appropriati al buio a temperatura ambiente.
Per terminare l'incubazione, aggiungere 400 microlitri di PBS alla provetta e agitarla delicatamente. Filtrare la sospensione cellulare in una rete di nylon da 35 micrometri fissata a un tubo da cinque millilitri, in polistirene, a fondo tondo. Immergere un vetro di copertura pulito in una soluzione di allume di cromo per due ore e asciugarlo in un forno a 37 gradi Celsius.
Pellettare le cellule tripsinizzate come dimostrato in precedenza e fissare le cellule con 500 microlitri di fissativo per microscopio elettronico per due ore a temperatura ambiente, seguite da un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. Dopo aver raccolto le celle dalla soluzione fissa, pellettare a 300 G per tre minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 100 microlitri di PBS e soffiare via delicatamente le cellule.
Far cadere la sospensione della cella su un vetro di copertura e lasciarla riposare per cinque minuti. Aspirare tutto il surnatante e lavare le cellule tre volte con PBS per cinque minuti ciascuna. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di fissazione dell'acido osmico all'1%.
Dopo un'ora, aspirare tutto il surnatante. Dopo tre lavaggi PBS, disidratare i campioni in concentrazioni crescenti di etanolo. Accendere l'essiccatore a punto critico, aprire il serbatoio dell'anidride carbonica e raffreddare la camera a 10 gradi Celsius.
Avvolgere rapidamente il campione con carta da filtro e inserirlo nella camera quando la pressione della camera è di zero libbre per pollice quadrato. Una volta che la temperatura si stabilizza a 35 gradi Celsius e la pressione raggiunge 1.250 libbre per pollice quadrato, depressurizzare a 100 libbre per pollice quadrato al minuto. Estrarre il campione quando la pressione della camera è zero.
Infine, utilizzando del nastro conduttivo, montare i campioni su un microscopio elettronico a scansione, portacampioni in alluminio utilizzando un codificatore sputter. Copri i campioni con uno strato d'oro da due a cinque nanometri. L'analisi della citometria a flusso ha mostrato che dopo la stimolazione di LPS/ATP, le cellule nella regione QT sono aumentate in modo significativo, indicando la morte cellulare.
Le micrografie elettroniche a scansione della superficie della membrana plasmatica hanno mostrato le caratteristiche della piroptosi, tra cui il blebbing e la rottura della membrana nelle cellule stimolate con LPS/ATP, mentre le cellule di controllo sembravano normali. Inoltre, la stimolazione di LPS/ATP ha portato alla comparsa di caratteristiche apoptotiche nelle cellule, come il blebbing della membrana e il restringimento cellulare, e sono state osservate cellule con caratteristiche di necroptosi, tra cui rigonfiamento cellulare e rottura della membrana.
