Prepararsi per l'imaging utilizzando un microscopio confocale due giorni dopo la trasfezione dei neuroni primari dell'ippocampo. Riscaldare l'attacco della camera cellulare viva 60 volte l'olio soggettivo e l'olio per lenti a 37 gradi Celsius ed equilibrare la camera al 5% di CO2. Utilizzando gli oculari, identificare i neuroni trasfettati nel canale contenente la proteina di carico.
Quindi, fare clic su scansione per visualizzare i neuroni e identificare il segmento iniziale dell'assone del canale SCI-5. Impostare il campo visivo su un riquadro rettangolare di 32 x 128 pixel e spostarlo per visualizzare una regione dell'assone, da 50 a 150 micron distale al segmento iniziale dell'assone. Registra la direzionalità del trasporto merci e l'orientamento del ROI, quindi premi salva con nome per salvarlo come file.
Si noti che i punti sulla casella appariranno in alto e a destra nelle immagini successive. Registrare il lato dell'immagine più vicino al corpo cellulare e il lato più vicino all'estremità dell'assone per garantire il corretto orientamento della polilinea del comagramma. Impostate la potenza del laser 561 su 1,40, il foro stenopeico su 7,8, la dimensione su 128 pixel quadrati e la velocità su 32 fotogrammi al secondo.
Regola il guadagno per visualizzare il trasporto delle singole vescicole del carico senza essere oscurato dal segnale di fondo. Seleziona Disegna ROI rettangolare dal menu a discesa ROI e disegna la ROI in modo che copra l'intero campo visivo. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Usa come stimolazione ROI S1. Quindi, nella scheda di configurazione ND, fare clic su acquisisci immagine per raccogliere l'immagine di riferimento pre-stimolazione.
Quindi impostare la stimolazione su ROI S1, l'intervallo su nessun ritardo, la durata di 1,64 secondi e i loop su sette. Quindi fare clic su acquisisci immagine per raccogliere l'immagine di riferimento post stimolazione. Selezionare l'attesa, nessuna acquisizione, due minuti per fornire un periodo di recupero per il carico fluorescente per ripopolare il ROI sbiancato.
Seleziona l'intervallo di acquisizione, nessun ritardo, durata cinque minuti, loop, 8, 615. Fare clic sul pulsante Applica impostazioni di stimolazione nella scheda Configurazione ND, quindi su Esegui ora. Raccogli anche video di trasporto da due neuroni per l'analisi.
Reimposta il campo visivo sull'intera immagine e quindi raccogli un'immagine dell'intero neurone nei canali 561 e 647 con la casella ROI inclusa. Registrare le coordinate XY in cui è stata scattata l'immagine per la conferma post-fissazione dell'espressione proteica. Utilizzando questo protocollo è stato eseguito l'imaging su cellule vive di un neurone trasfettato che esprime la sinaptofisina della proteina cargo mAPL.
È stato anche marcato il dominio esterno della neuro fasina nel segmento iniziale dell'assone. L'imaging del trasporto merci è stato eseguito nella regione assonale di interesse. Ulteriori analisi di immunofluorescenza post-imaging hanno confermato la co-espressione della proteina tau e della sinaptofisina mAPL.
