Ottenere organoidi gastrici umani precedentemente preparati per il profilo del pH. Per iniziare, collegare l'elettrodo di riferimento al cavo dell'elettrodo pH tramite il connettore. Quindi, collegare il microelettrodo all'amplificatore e l'amplificatore a un PC con messa a terra con il software tramite cavo USB.
Posizionare il microelettrodo e l'elettrodo di riferimento in acqua deionizzata per immergere entrambe le punte di almeno un centimetro nel liquido. Riempire le provette coniche da 50 millilitri con i tamponi di calibrazione desiderati. Utilizzando un panno da laboratorio delicato, tamponare delicatamente il tubo protettivo insieme all'elettrodo di riferimento.
Dopo aver aperto il software, nella scheda di calibrazione, selezionare la casella Y-Zoom e quindi impostare la lettura del segnale del sensore su millivolt. Iniziando con gli elettrodi nel tampone pH 4.01, inserire 4.01 come valore pH noto. Selezionare Aggiungi punto una volta che la lettura in millivolt si stabilizza, quindi riposizionare entrambi gli elettrodi in acqua deionizzata per risciacquarli.
Dopo aver ripetuto il processo per il tampone pH 9,21, fare clic su Aggiungi punto quando il segnale è stabile a circa 83 millivolt. Verificare che i microelettrodi rispondano linearmente tra pH 4,01 e 9,21 per una curva di calibrazione a due punti. Appoggiare con cautela la custodia di protezione sul banco ed estrarla con un movimento rapido e rapido per rimuovere il microelettrodo.
Montare il microelettrodo su un micromanipolatore e disporre lo stereoscopio e il micromanipolatore in modo che il microelettrodo possa avanzare liberamente verso la piastra di coltura. Posizionare il piatto di coltura contenente gli organoidi per la profilazione. Fissare leggermente l'elettrodo di riferimento al morsetto sul supporto ad anello a sinistra dello stereoscopio.
Far avanzare visivamente la punta del microelettrodo fino a quando non è sufficientemente immersa nel fluido. Una volta che il segnale si è stabilizzato, registrare tre letture di pH del terreno. Quindi, far avanzare lentamente il microelettrodo nell'ECM senza toccare alcun organoide.
Registrare almeno tre letture del pH per calcolare la media. Posizionare il microelettrodo lungo l'asse perpendicolare alla superficie dell'organoide, praticando delicatamente una piccola rientranza sulla superficie basolaterale dell'organoide senza penetrarla. Far avanzare con cautela il microelettrodo nell'organoide e misurare il pH luminale.
Al termine, procedere alla misurazione del pH per l'organoide successivo. Riposizionare l'elettrodo da pulire nel suo tubo di protezione. Lavare l'elettrodo in serie con acqua deionizzata, etanolo e tampone.
Posizionare l'elettrodo di riferimento in un becher riempito con una soluzione di cloruro di potassio a tre molari. Riempire un capillare di vetro da due microlitri con olio minerale sterile e caricarlo su un autoiniettore di nanolitri controllato da micromanipolatore. Infine, riempirlo con una soluzione contenente lo 0,02% di rosso metile e 150 millimolari di acido cloridrico ed eseguire l'iniezione con 9,2 nanolitri di soluzione.
La variazione del pH luminale tra 10 organoidi sulla stessa piastra di coltura è stata minima, con misurazioni costanti intorno a 8,16. Il pH intraluminale in cinque diverse linee di organoidi era coerente all'interno di ciascuna coltura, ma è stata osservata una variabilità significativa tra le linee di organoidi. Il pH luminale dell'organoide era costantemente inferiore a quello degli ECM, che a loro volta erano inferiori al pH del terreno, suggerendo che il pH luminale è fisiologicamente rilevante e non determinato esclusivamente dall'ambiente di coltura circostante.
L'iniezione di rosso metile nel lume dell'organoide ha confermato che aveva un pH superiore a 6,2, coerente con le misurazioni dei microelettrodi che mostravano un pH quasi neutro.
